Oznaczenie kwaśnej fosfatazy, zwłaszcza jej izoenzymu sterczowego w surowicy krwi, jest jednym z badań biochemicznych o szczególnie du-żym znaczeniu w diagnostyce raka stercza. Uważa się, że wzrost aktywności enzymu w surowicy krwi jest charakterystyczny dla rozwoju procesu nowotworowego (4, 6, 10, 20). Oznaczenie to jest przydatne zarówno w ocenie stopnia zaawansowania klinicznego nowotworu, jak i niezaprzeczalną jest jego wartość w kontroli efektywności leczenia (12, 20). Jednak stosunkowo niska swoistość stosowanych substratów jak i inhibitorów poszczególnych izoenzymów w metodach pomiaru aktywności kwaśnej fosfatazy, rzutujące na jakość wyników oznaczeń, spowodowały że w pewnym okresie zainteresowanie tym enzymem w aspekcie jego przydatności w diagnostyce raka stercza uległo osłabieniu.
Nowy etap w dziedzinie badań nad kwaśną fosfatazą sterczową (PAP) zapoczątkowało stwierdzenie przez Shulmana i wsp. immunogennych własności tego izoenzymu (16). Opracowano na tej podstawie szereg metod oznaczania PAP w oparciu o techniki immunodyfuzji i immunoelektroforezy. Na tej również podstawie opiera się opracowana przez Fotiego i Coopera w 1974 r. metoda radioimmunologicznego (RIA) oznaczania stężenia PAP (5). Pierwsze entuzjastyczne doniesienie zawierało opinię, że metodą tą można stwierdzić podwyższony poziom PAP w osoczu u dużego odsetka chorych z rakiem nieprzechodzącym poza torebkę stercza, a nawet u chorych w stadium A zaawansowania klinicznego choroby. Późniejsze doniesienia na temat metody RIA 'były znaczenie bardziej krytycznie, ale szeroko prowadzona weryfikacja przydatności tej metody w diagnostyce raka stercza wykazała jej znaczną przewagę nad metodami spektrofotometrycznego oznaczania aktywności (7, 9, 14, 15, 18).
Metoda RIA łączy w sobie wysoką swoistość reakcji immunologicznej z wysoką czułością pomiaru radioaktywności. Jedyny zasadniczo wysuwany zarzut przeciwko metodom radioimmunologicznym jest właśnie związany z użyciem w nich do znakowania antygenu izotopów promie-niotwórczych. Problem skażeń radioaktywnych, konieczność posiadania kosztownej, specjalistycznej aparatury pomiarowej, jaką są liczniki promieniowania oraz pracowni izotopowych, spełniających określone warun-ki ochronności, ograniczają powszechność stosowania metod radioimmu-nologicznych, a jednocześnie podnoszą koszt jednostkowy oznaczenia. Alternatywę w stosunku do tych metod stanowią metody enzymoimmunologiczne (EIA), w których do znakowania antygenu stosuje się enzym i których wykonanie jest możliwe w warunkach typowego laboratorium diagnostycznego, a wymaganą aparaturą pomiarową jest spektrofotometr. Choe i Grenner opracowali w 1979 r. równolegle metody enzymoimmu-nologicznego oznaczania stężenia PAP (2, 8).
Celem niniejszej pracy było porównanie metody EIA według Gren-nera oznaczania PAP z metodą radioimmunologiczną, którą posługujemy się już od kilku lat.
MATERIAŁ I METODY
Oznaczenia PAP metodą radioimmunologiczną i enzymoimmunologiczną wykonano w 209 surowicach krwi pochodzących od 18 zdrowych mężczyzn, 8 zdrowych kobiet, 65 chorych na gruczolak stercza przed operacją i 63 chorych na raka stercza przed leczeniem (stadium zaawansowania klinicznego A ? 16 chorych, stadium B ? 17, stadium C ? 18, stadium D ? 12). Ponadto wykonano oznaczenia w 55 surowicach krwi pobranych od chorych na raka stercza w okresach 6 i 12 miesięcy od rozpoczęcia leczenia. Wszyscy chorzy byli badani i leczeni w Klinice Urologii Akademii Medycznej w Krakowie. Rozpoznania u wszystkich chorych potwierdzono badaniem mikroskopowym wykonanym w Instytucie Patologii Akademii Medyczne1] w Krakowie (Kierownik: prof. dr hab. med. Anna Urban). Ocenę stopnia zaawansowania klinicznego oparto o zasady klasyfikacji Whitmore'a (17). Wiek badanych wahał się od 48 do 76 lat.
Krew do badań pobierano w warunkach standardowych, surowicę prze
chowywano w stanie zamrożonym w temperaturze ?25°C.
Oznaczenia metodą radioimmunologiczną wykonano stosując zestawy RIA Quant PAP produkcji Byk Mallinckrodt Inc. (5). W skład zestawu wchodzą: przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej PAP, znakowany izotopem 125-jod antygen oraz roztwór glikolu polietylenowego zawierający drugie przeciwciało, który służy do izolacji powstającego kompleksu. W reakcja pomiędzy przeciwciałem, a antygenem znakowanym i zimnym, którym jest PAP z badanej surowicy powstaje kompleks, którego radioaktywność zmierzona po wyizolowaniu go z mieszaniny reakcyjnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia PAP w badanej surowicy krwi. Pomiary radioaktywności wykonywano w liczniku scyntylacyjnym Gamma 8500 Beckman. Dla każdej serii badań oznaczono roztwory wzorcowe w zakresie stężeń od 1,0 do 40,0 ?g/l oraz niespecyficzne wiązanie. Stężenie PAP w surowicy odczytywano z krzywej wzorcowej wykreślonej w pół-logarytmicznym układzie współrzędnych dla zależności procentu wiązania w odniesieniu do próby zerowej względem stężenia enzymu.
Oznaczania metodą enzymoimmunologiczną wykonywano przy użyciu zestawów ENZYGNOST PAP produkcji Behring Inst. (4, 8). Zestaw ten oparty na technice sandwich zawiera przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej PAP opłaszczone na probówkach polistyrenowych, drugie przeciwciało również skierowane przeciw fosfatazie i związane z peroksydazą oraz roztwory substratu i chromogenu dla oznaczania aktywności pero-ksydazy metodą ?do punktu końcowego". W pierwszym etapie oznaczenia antygen z badanej surowicy wiąże się z przeciwciałem opłaszczonym na ściankach probówki, następnie wchodzi w reakcję z dodawanym drugim przeciwciałem i powstaje kompleks: pierwsze przeciwciało ? antygen ? drugie przeciwciało ? peroksydaza. Zmierzona metodami spektro-fotometrycznymi aktywność peroksydazy z użyciem nadtlenku wodoru jako substratu i dwuchlorowodorku orto-fenylenodwuaminy jako chromo-genu reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia PAP w badanej surowicy. Pomiary spektrofotometryczne wykonywano na fotokolorymet-rze Vitatron MPS przy długości fali 500 ?m wobec wody destylowanej jako próby ślepej, Dla każdej serii oznaczano roztwory wzorcowe w zakresie stężeń od 0,3 do 30,0 ?g/h Stężenie PAP odczytywano z krzywe] wzorcowej wykreślonej w logarytmicznym układzie współrzędnych dla zależności ekstynkcji względem stężenia enzymu.
W obu metodach oznaczenie surowic wykonywano w podwójnych próbkach, natomiast roztworów wzorcowych, niespecyficznego wiązania w potrójnych. Jeśli stężenie PAP w surowicy przekraczało zakres pomiarowy dla danej metody, oznaczania powtarzano po uprzednim rozcieńczeniu surowicy.
Dla każdej z metod pomiarowych przeprowadzono ocenę dokładności na podstawie próby odzysku, powtarzalności oraz określono zmienność wewnątrz i pomiędzy seryjną. Wyniki przedstawiono w tabeli I.
Wynikli oznaczeń stężenia PAP w surowicy krwi metodą RIA i EIA opracowano statystycznie. Opracowanie to obejmowało poza standardo-wym opisem, ocenę różnic pomiędzy badanymi grupami na podstawie nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa, ocenę różnic wartości odsetkowych za pomocą testu ,,u" oraz rachunek korelacji i regresji z wyznaczeniem przedziału ufności dla linii regresji (19).
WYNIKI
Oceny współzależności pomiędzy wynikami stężenia PAP oznaczanej metodą radioimmunologiczną oraz enzymoimmunologiczną nie można było dokonać na podstawie surowych wartości pomiarowych, zastosowano więc ich transformację logarytmiczną. Przeprowadzony rachunek korelacji dla logarytmów wartości stężeń oznaczanych metodą RIA i EIA wykazał, że pomiędzy wynikami istnieje znamienna statystycznie, dodatnia współzależność, wyrażająca się współczynnikiem korelacji równym 0,90 (p<0,001). Równanie regresji w logarytmicznym układzie współrzędnych wykazuje wysoką zgodność z prostoliniowym przebiegiem (p<0,001), przedział ufności dla linii regresji przy prawdopodobieństwie wynoszącym 0,95 jest stosunkowo wąski, zwłaszcza dla stężeń odpowiadających zakresom pomiarowym zestawów, tj. 30 ?g/l dla EIA i 40,0 ?g/l dla RIA. Po prze-kształceniu równanie regresji przyjmuje postać funkcji potęgowej y = 2,54? x0'833. (ryc. 1).
Zakresy normy, ustalone na podstawie oznaczeń wykonanych w surowicach krwi zdrowych mężczyzn, wynoszą dla metody RIA od 0,0 do 2,55 ?g/1, a dla EIA ad 0,0 do 1,00 ?g/l. Zakres normy dla metody RIA w naszych badaniach jest nieco szerszy aniżeli podawany przez producenta zestawów, natomiast dla EIA jest identyczny. U żadnej z badanych kobiet nie stwierdzono wartości stężenia kwaśnej fosfatazy sterczowej przekraczających poziom 0,50 ?g/l dla RIA i 0,26 ?g/l dla EIA, przy czym większość wyników była równa zeru.
U chorych na raka stercza poziom PAP wykazywał ogromną rozpiętość, od wartości mieszczących się w granicach zakresu normy, aż do bardzo wysokich. Najwyższy poziom obserwowany w tej grupie chorych , wynosił 329,8 ?g/l w metodzie RIA i 309,2 ?g/1 w EIA. Różnice w stężeniu PAP pomiędzy chorymi na raka stercza, a grupą kontrolną były znamienne statystycznie zarówno dla jednej jak i drugiej metody pomiarowej (w obu grupkach p<0,05). Wynika przekraczające górną granicę normy u chorych na raka stercza stwierdzono w metodzie RIA u 60,3%, a w metodzie EIA u 61,9% badanych. Rozkład odsetkowy wyników w poszczególnych stadiach zaawansowania klinicznego przedstawiono w tabeli II. Granice przedziałów stężeń przyjęto w ten sposób, alby były one sobie równoważne. Na podstawie przyjętych wartości przedziałów stężeń dla metody EIA, w oparciu o równanie regresji, obliczono dla metody radioimmunologicznej odpowiadające wartości przedziałów. Jak wynika to z tabeli odsetki chorych mieszczących się w poszczególnych przedziałach stężeń są dla obu metod bardzo podobne.
Tabela II. Odsetkowy rozkład wyników stężenia kwaśnej fosfatazy sterczowej u chorych na raka stercza w poszczególnych stadiach zaawansowania klinicznego
(metoda RIA I EIA)
Analiza wyników w grupie chorych na raka stercza, u których badania wykonano nie tylko wyjściowo przed rozpoczęciem leczenia, ale także w okresach 6 i 12 miesięcy od tego momentu, wykazała całkowitą zgodność kierunku zmian stężenia PAP u poszczególnych badanych w obu metodach jej oznaczania. Pewne różnice dotyczyły jedynie nasilenia tych zmian, przy czym zasadniczo mieściły się one w zakresie wartości dopuszczalnych na podstawie przyjętego przedziału ufności dla równania regresji.
DYSKUSJA
Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że metody radioimmunologiczne i enzymoimmunologiczne oznaczenia stężenia PAP w surowicy krwi są w znacznej mierze równoważne. Potwierdzeniem takiego stanowiska jest m. in. fakt, że jeżeli do równania opisującego zależność pomiędzy wynikami EIA i RIA podstawimy wartość górnej granicy normy dla metody enzymoimmunologicznej, to otrzymamy dla metody RIA wartość zgodną z ustaloną doświadczalnie górną granicą normy dla tej metody.
Przewaga metod radio- i enzymoimmunologicznych w stosunku do metod pomiaru aktywności enzymatycznej PAP polega na ich swoistości oraz znacznie wyższej trwałości immunologicznej reaktywności izoenzymu sterczowego (1, 3). Nie przeszkadza w oznaczeniach tymi metodami chemoliza i obecność w surowicy krwi czynnika reumatoidalnego. Na wynik nie mają również wpływu używane środki antykoagulujące jak heparyna, wersenian lub cytrynian (1, 5, 8). Aktywność PAP w surowicy krwi w temperaturze 25°C spada znacznie już po kilku godzinach, a jest całkowicie niemierzalna po 2?3 dniach; natomiast zauważalny spadek aktywności immunologicznej występuje dopiero po upływie 5 do 8 dni przy przechowywaniu surowicy w temperaturze 25°C (1).
Wprowadzenie przez Fotiego i Coopera metody RIA oznaczania stężenia PAP, zapoczątkowało nowy etap badań nad rolą tego izoenzymu w diagnostyce raka stercza. Z jednej strony kolejni badacze publikują dane odnośnie własnych opracowań metod RIA dla tego enzymu (5, 9), z drugiej strony prowadzi się szeroką weryfikację przydatności jego oznaczeń tak we wczesnej diagnostyce raka stercza jak i ocenie stopnia zaawansowania procesu nowotworowego, dla identyfikacji odległych przerzutów, dla oceny efektywności leczenia i jego kontroli (11, 13, 20). Wyższość metod RIA mad badaniami aktywności enzymatycznej zyskała powszechne uznanie. Podkreśla się szczególną przydatność metody RIA dla kontroli leczenia i monitorowania jego przebiegu. Nie nadaje się ona natomiast do wykrywania raka Stercza w populacji, a więc do badań skri-ningowych. Dotychczasowe wyniki badań porównawczych oznaczania PAP za pomocą RIA i EIA pozwalają przyjąć, że są one w wysokim stopniu równoważne.
Powstaje pytanie, która z metod oznaczania stężenia PAP powinna znaleźć się w powszechnym użytku? Metody radlioimmunologiczne posiadają cały szereg zalet, ale posiadają też pewne wady związane głównie z zastosowaniem w nich jako znaczników izotopów promieniotwórczych. Jakkolwiek radioaktywność pojedynczej próbki czy nawet całego zestawu jest minimalna, to jednak aktywności używane przy przygotowaniu zestawów we własnym zakresie (jodowanie antygenów), a tym bardziej aktywności używane przy produkcji komercyjnej zestawów stanowią już poważny problem. Druga sprawa z tym związana to konieczność posiadania specjalistycznej, bardzo kosztownej aparatury pomiarowej ? licznika promieniowania. I ostatnia ? to konieczność prowadzenia badań wyłącznie w pracowniach izotopowych spełniających określone wymagania ochronnie. Czynniki te podnoszą znacznie koszt jednostkowy badania, a ponadto ograniczają możliwości ich wykonania. Z tych właśnie względów metody enzymoimmunologiczne mają przewagę nad metodami RIA i obserwuje się obecnie bardzo intensywny ich rozwój. Posiadając podobną swoistość do metod RIA i niewiele im stosunkowo ustępując w czułości, nie wymagają specjalnych pracowni ani specjalnej aparatury pomiarowej. Można je zasadniczo wykonywać w każdej standardowo wyposażonej pracowni diagnostycznej. Ostatni etap w metodzie enzymoimmunologicznej to pomiar aktywności enzymu użytego jako znacznika, którym najczęściej jest peroksydaza. Należy uwzględnić możliwość wpływu szeregu czynników interferujących w pomiarach aktywności enzymatycznej tak fizycznych (np. temperatura, światło), jak i chemicznych (inhibitory, aktywatory). Przy pomiarach spektrofotometrycznych aktywności enzymu czynniki te w znacznym stopniu mogą wpływać na jakość wyników.
Wydaje się, że metody radioimmunologiczne oznaczania stężenia kwaśnej fosfatazy sterczowej stanowią pewnego typu metody referencyjne, natomiast metody enzymoimmunologiczne, zwłaszcza w miarę ich doskonalenia, powinny znaleźć szerokie zastosowanie w praktyce laboratoryjnej.
Wnioski
1.Wyniki oznaczania stężenia PAP w surowicy krwi metodą radio-
i enzymoimmunologiczną są w znacznej mierze równoważne.
2.Zaletą metody EIA jest fakt, że nie wymaga znaczników izotopo-
tyce laboratoryjnej. wo-promieniotwórczych i specjalistycznej aparatury pomiarowej. Metoda EIA oznaczania PAP powinna znaleźć szerokie zastosowanie w praktyce laboratoryjnej.