PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

KWAŚNA FOSFATAZA STERCZOWA (PAP) W OSOCZU ? PORÓWNANIE METODY RADIO- I ENZYMOIMMUNOLOGICZNEGO OZNACZANIA STĘŻENIA
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1985/38/1.

autorzy

Jan Kulpa, Adam Kwinta
Z Zakładu Analityki i Biochemii Klinicznej
Instytutu Onkologii Oddział w Krakowie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. A. Marczyńska
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. med. J. Skołyszewski
Z Katedry i Kliniki Urologii AM w Krakowie
Kierownik Kliniki: prof. zw. dr med. J. Leńko

streszczenie

Stosując metody ? radioimmunologiczną (RIA) i enzymoimmuno­logiczną (EIA) oznaczono stężenie kwaśnej fosfatazy sterczowej w 209 próbkach surowicy krwi pochodzących od 63 chorych na raka stercza, 65 chorych na gruczolak stercza oraz 26 osób zdrowych. Stwierdzono, że wyniki uzyskane za pomocą obu metod są w znacznej mierze rów­noważne. Zaletą między innymi EIA jest fakt, że nie wymaga znacz­ników izotopowo-promieniotwórczych i specjalistycznej aparatury po­miarowej. Metoda EIA oznaczania PAP powinna znaleźć szerokie za­stosowanie w praktyce lekarskiej.

Oznaczenie kwaśnej fosfatazy, zwłaszcza jej izoenzymu sterczowego w surowicy krwi, jest jednym z badań biochemicznych o szczególnie du-żym znaczeniu w diagnostyce raka stercza. Uważa się, że wzrost aktyw­ności enzymu w surowicy krwi jest charakterystyczny dla rozwoju pro­cesu nowotworowego (4, 6, 10, 20). Oznaczenie to jest przydatne zarów­no w ocenie stopnia zaawansowania klinicznego nowotworu, jak i nie­zaprzeczalną jest jego wartość w kontroli efektywności leczenia (12, 20). Jednak stosunkowo niska swoistość stosowanych substratów jak i inhi­bitorów poszczególnych izoenzymów w metodach pomiaru aktywności kwaśnej fosfatazy, rzutujące na jakość wyników oznaczeń, spowodowały że w pewnym okresie zainteresowanie tym enzymem w aspekcie jego przydatności w diagnostyce raka stercza uległo osłabieniu.

Nowy etap w dziedzinie badań nad kwaśną fosfatazą sterczową (PAP) zapoczątkowało stwierdzenie przez Shulmana i wsp. immunogennych własności tego izoenzymu (16). Opracowano na tej podstawie szereg me­tod oznaczania PAP w oparciu o techniki immunodyfuzji i immunoelek­troforezy. Na tej również podstawie opiera się opracowana przez Fotiego i Coopera w 1974 r. metoda radioimmunologicznego (RIA) oznaczania stę­żenia PAP (5). Pierwsze entuzjastyczne doniesienie zawierało opinię, że metodą tą można stwierdzić podwyższony poziom PAP w osoczu u du­żego odsetka chorych z rakiem nieprzechodzącym poza torebkę stercza, a nawet u chorych w stadium A zaawansowania klinicznego choroby. Późniejsze doniesienia na temat metody RIA 'były znaczenie bardziej kry­tycznie, ale szeroko prowadzona weryfikacja przydatności tej metody w diagnostyce raka stercza wykazała jej znaczną przewagę nad metodami spektrofotometrycznego oznaczania aktywności (7, 9, 14, 15, 18).

Metoda RIA łączy w sobie wysoką swoistość reakcji immunologicznej z wysoką czułością pomiaru radioaktywności. Jedyny zasadniczo wysu­wany zarzut przeciwko metodom radioimmunologicznym jest właśnie związany z użyciem w nich do znakowania antygenu izotopów promie-niotwórczych. Problem skażeń radioaktywnych, konieczność posiadania kosztownej, specjalistycznej aparatury pomiarowej, jaką są liczniki pro­mieniowania oraz pracowni izotopowych, spełniających określone warun-ki ochronności, ograniczają powszechność stosowania metod radioimmu-nologicznych, a jednocześnie podnoszą koszt jednostkowy oznaczenia. Al­ternatywę w stosunku do tych metod stanowią metody enzymoimmunolo­giczne (EIA), w których do znakowania antygenu stosuje się enzym i których wykonanie jest możliwe w warunkach typowego laboratorium diagnostycznego, a wymaganą aparaturą pomiarową jest spektrofotometr. Choe i Grenner opracowali w 1979 r. równolegle metody enzymoimmu-nologicznego oznaczania stężenia PAP (2, 8).

Celem niniejszej pracy było porównanie metody EIA według Gren-nera oznaczania PAP z metodą radioimmunologiczną, którą posługujemy się już od kilku lat.

MATERIAŁ I METODY

Oznaczenia PAP metodą radioimmunologiczną i enzymoimmunologicz­ną wykonano w 209 surowicach krwi pochodzących od 18 zdrowych męż­czyzn, 8 zdrowych kobiet, 65 chorych na gruczolak stercza przed opera­cją i 63 chorych na raka stercza przed leczeniem (stadium zaawansowa­nia klinicznego A ? 16 chorych, stadium B ? 17, stadium C ? 18, sta­dium D ? 12). Ponadto wykonano oznaczenia w 55 surowicach krwi po­branych od chorych na raka stercza w okresach 6 i 12 miesięcy od roz­poczęcia leczenia. Wszyscy chorzy byli badani i leczeni w Klinice Uro­logii Akademii Medycznej w Krakowie. Rozpoznania u wszystkich cho­rych potwierdzono badaniem mikroskopowym wykonanym w Instytucie Patologii Akademii Medyczne1] w Krakowie (Kierownik: prof. dr hab. med. Anna Urban). Ocenę stopnia zaawansowania klinicznego oparto o zasady klasyfikacji Whitmore'a (17). Wiek badanych wahał się od 48 do 76 lat.

Krew do badań pobierano w warunkach standardowych, surowicę prze­ chowywano w stanie zamrożonym w temperaturze ?25°C.

Oznaczenia metodą radioimmunologiczną wykonano stosując zesta­wy RIA Quant PAP produkcji Byk Mallinckrodt Inc. (5). W skład ze­stawu wchodzą: przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej PAP, znako­wany izotopem 125-jod antygen oraz roztwór glikolu polietylenowego za­wierający drugie przeciwciało, który służy do izolacji powstającego kom­pleksu. W reakcja pomiędzy przeciwciałem, a antygenem znakowanym i zimnym, którym jest PAP z badanej surowicy powstaje kompleks, którego radioaktywność zmierzona po wyizolowaniu go z mieszaniny reakcyjnej jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia PAP w badanej surowicy krwi. Pomiary radioaktywności wykonywano w liczniku scyntylacyjnym Gam­ma 8500 Beckman. Dla każdej serii badań oznaczono roztwory wzorcowe w zakresie stężeń od 1,0 do 40,0 ?g/l oraz niespecyficzne wiązanie. Stęże­nie PAP w surowicy odczytywano z krzywej wzorcowej wykreślonej w pół-logarytmicznym układzie współrzędnych dla zależności procentu wią­zania w odniesieniu do próby zerowej względem stężenia enzymu.

Oznaczania metodą enzymoimmunologiczną wykonywano przy użyciu zestawów ENZYGNOST PAP produkcji Behring Inst. (4, 8). Zestaw ten oparty na technice sandwich zawiera przeciwciało skierowane przeciw ludzkiej PAP opłaszczone na probówkach polistyrenowych, drugie prze­ciwciało również skierowane przeciw fosfatazie i związane z peroksydazą oraz roztwory substratu i chromogenu dla oznaczania aktywności pero-ksydazy metodą ?do punktu końcowego". W pierwszym etapie oznacze­nia antygen z badanej surowicy wiąże się z przeciwciałem opłaszczonym na ściankach probówki, następnie wchodzi w reakcję z dodawanym dru­gim przeciwciałem i powstaje kompleks: pierwsze przeciwciało ? anty­gen ? drugie przeciwciało ? peroksydaza. Zmierzona metodami spektro-fotometrycznymi aktywność peroksydazy z użyciem nadtlenku wodoru jako substratu i dwuchlorowodorku orto-fenylenodwuaminy jako chromo-genu reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia PAP w badanej su­rowicy. Pomiary spektrofotometryczne wykonywano na fotokolorymet-rze Vitatron MPS przy długości fali 500 ?m wobec wody destylowanej jako próby ślepej, Dla każdej serii oznaczano roztwory wzorcowe w za­kresie stężeń od 0,3 do 30,0 ?g/h Stężenie PAP odczytywano z krzywe] wzorcowej wykreślonej w logarytmicznym układzie współrzędnych dla zależności ekstynkcji względem stężenia enzymu.

W obu metodach oznaczenie surowic wykonywano w podwójnych próbkach, natomiast roztworów wzorcowych, niespecyficznego wiązania w potrójnych. Jeśli stężenie PAP w surowicy przekraczało zakres po­miarowy dla danej metody, oznaczania powtarzano po uprzednim roz­cieńczeniu surowicy.

Dla każdej z metod pomiarowych przeprowadzono ocenę dokładnoś­ci na podstawie próby odzysku, powtarzalności oraz określono zmien­ność wewnątrz i pomiędzy seryjną. Wyniki przedstawiono w tabeli I.

Wynikli oznaczeń stężenia PAP w surowicy krwi metodą RIA i EIA opracowano statystycznie. Opracowanie to obejmowało poza standardo-wym opisem, ocenę różnic pomiędzy badanymi grupami na podstawie nieparametrycznego testu Kruskala-Wallisa, ocenę różnic wartości od­setkowych za pomocą testu ,,u" oraz rachunek korelacji i regresji z wy­znaczeniem przedziału ufności dla linii regresji (19).

WYNIKI

Oceny współzależności pomiędzy wynikami stężenia PAP oznaczanej metodą radioimmunologiczną oraz enzymoimmunologiczną nie można było dokonać na podstawie surowych wartości pomiarowych, zastosowano więc ich transformację logarytmiczną. Przeprowadzony rachunek korelacji dla logarytmów wartości stężeń oznaczanych metodą RIA i EIA wykazał, że pomiędzy wynikami istnieje znamienna statystycznie, dodatnia współza­leżność, wyrażająca się współczynnikiem korelacji równym 0,90 (p<0,001). Równanie regresji w logarytmicznym układzie współrzędnych wykazuje wysoką zgodność z prostoliniowym przebiegiem (p<0,001), przedział uf­ności dla linii regresji przy prawdopodobieństwie wynoszącym 0,95 jest stosunkowo wąski, zwłaszcza dla stężeń odpowiadających zakresom po­miarowym zestawów, tj. 30 ?g/l dla EIA i 40,0 ?g/l dla RIA. Po prze-kształceniu równanie regresji przyjmuje postać funkcji potęgowej y = 2,54? x0'833. (ryc. 1).

Zakresy normy, ustalone na podstawie oznaczeń wykonanych w su­rowicach krwi zdrowych mężczyzn, wynoszą dla metody RIA od 0,0 do 2,55 ?g/1, a dla EIA ad 0,0 do 1,00 ?g/l. Zakres normy dla metody RIA w naszych badaniach jest nieco szerszy aniżeli podawany przez produ­centa zestawów, natomiast dla EIA jest identyczny. U żadnej z bada­nych kobiet nie stwierdzono wartości stężenia kwaśnej fosfatazy ster­czowej przekraczających poziom 0,50 ?g/l dla RIA i 0,26 ?g/l dla EIA, przy czym większość wyników była równa zeru.

U chorych na raka stercza poziom PAP wykazywał ogromną rozpię­tość, od wartości mieszczących się w granicach zakresu normy, aż do bardzo wysokich. Najwyższy poziom obserwowany w tej grupie chorych , wynosił 329,8 ?g/l w metodzie RIA i 309,2 ?g/1 w EIA. Różnice w stężeniu PAP pomiędzy chorymi na raka stercza, a grupą kontrolną były znamienne statystycznie zarówno dla jednej jak i drugiej metody pomiaro­wej (w obu grupkach p<0,05). Wynika przekraczające górną granicę nor­my u chorych na raka stercza stwierdzono w metodzie RIA u 60,3%, a w metodzie EIA u 61,9% badanych. Rozkład odsetkowy wyników w po­szczególnych stadiach zaawansowania klinicznego przedstawiono w ta­beli II. Granice przedziałów stężeń przyjęto w ten sposób, alby były one sobie równoważne. Na podstawie przyjętych wartości przedziałów stężeń dla metody EIA, w oparciu o równanie regresji, obliczono dla metody radioimmunologicznej odpowiadające wartości przedziałów. Jak wynika to z tabeli odsetki chorych mieszczących się w poszczególnych przedzia­łach stężeń są dla obu metod bardzo podobne.

Tabela II. Odsetkowy rozkład wyników stężenia kwaśnej fosfatazy sterczowej u chorych na raka stercza w poszczególnych stadiach zaawansowania klinicznego (metoda RIA I EIA)

Analiza wyników w grupie chorych na raka stercza, u których ba­dania wykonano nie tylko wyjściowo przed rozpoczęciem leczenia, ale także w okresach 6 i 12 miesięcy od tego momentu, wykazała całkowitą zgodność kierunku zmian stężenia PAP u poszczególnych badanych w obu metodach jej oznaczania. Pewne różnice dotyczyły jedynie nasilenia tych zmian, przy czym zasadniczo mieściły się one w zakresie wartości dopuszczalnych na podstawie przyjętego przedziału ufności dla równa­nia regresji.

DYSKUSJA

Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że metody radioimmunologiczne i enzymoimmunologiczne oznaczenia stężenia PAP w surowicy krwi są w znacznej mierze równoważne. Potwierdzeniem ta­kiego stanowiska jest m. in. fakt, że jeżeli do równania opisującego za­leżność pomiędzy wynikami EIA i RIA podstawimy wartość górnej gra­nicy normy dla metody enzymoimmunologicznej, to otrzymamy dla me­tody RIA wartość zgodną z ustaloną doświadczalnie górną granicą nor­my dla tej metody.

Przewaga metod radio- i enzymoimmunologicznych w stosunku do metod pomiaru aktywności enzymatycznej PAP polega na ich swoistoś­ci oraz znacznie wyższej trwałości immunologicznej reaktywności izo­enzymu sterczowego (1, 3). Nie przeszkadza w oznaczeniach tymi me­todami chemoliza i obecność w surowicy krwi czynnika reumatoidalnego. Na wynik nie mają również wpływu używane środki antykoagulujące jak heparyna, wersenian lub cytrynian (1, 5, 8). Aktywność PAP w surowicy krwi w temperaturze 25°C spada znacznie już po kilku godzi­nach, a jest całkowicie niemierzalna po 2?3 dniach; natomiast zauwa­żalny spadek aktywności immunologicznej występuje dopiero po upływie 5 do 8 dni przy przechowywaniu surowicy w temperaturze 25°C (1).

Wprowadzenie przez Fotiego i Coopera metody RIA oznaczania stę­żenia PAP, zapoczątkowało nowy etap badań nad rolą tego izoenzymu w diagnostyce raka stercza. Z jednej strony kolejni badacze publikują dane odnośnie własnych opracowań metod RIA dla tego enzymu (5, 9), z drugiej strony prowadzi się szeroką weryfikację przydatności jego ozna­czeń tak we wczesnej diagnostyce raka stercza jak i ocenie stopnia za­awansowania procesu nowotworowego, dla identyfikacji odległych prze­rzutów, dla oceny efektywności leczenia i jego kontroli (11, 13, 20). Wyż­szość metod RIA mad badaniami aktywności enzymatycznej zyskała po­wszechne uznanie. Podkreśla się szczególną przydatność metody RIA dla kontroli leczenia i monitorowania jego przebiegu. Nie nadaje się ona na­tomiast do wykrywania raka Stercza w populacji, a więc do badań skri-ningowych. Dotychczasowe wyniki badań porównawczych oznaczania PAP za pomocą RIA i EIA pozwalają przyjąć, że są one w wysokim stopniu równoważne.

Powstaje pytanie, która z metod oznaczania stężenia PAP powinna znaleźć się w powszechnym użytku? Metody radlioimmunologiczne po­siadają cały szereg zalet, ale posiadają też pewne wady związane głównie z zastosowaniem w nich jako znaczników izotopów promieniotwórczych. Jakkolwiek radioaktywność pojedynczej próbki czy nawet całego ze­stawu jest minimalna, to jednak aktywności używane przy przygotowa­niu zestawów we własnym zakresie (jodowanie antygenów), a tym bar­dziej aktywności używane przy produkcji komercyjnej zestawów sta­nowią już poważny problem. Druga sprawa z tym związana to koniecz­ność posiadania specjalistycznej, bardzo kosztownej aparatury pomiaro­wej ? licznika promieniowania. I ostatnia ? to konieczność prowadzenia badań wyłącznie w pracowniach izotopowych spełniających określone wy­magania ochronnie. Czynniki te podnoszą znacznie koszt jednostkowy ba­dania, a ponadto ograniczają możliwości ich wykonania. Z tych właśnie względów metody enzymoimmunologiczne mają przewagę nad metodami RIA i obserwuje się obecnie bardzo intensywny ich rozwój. Posiadając podobną swoistość do metod RIA i niewiele im stosunkowo ustępując w czułości, nie wymagają specjalnych pracowni ani specjalnej aparatury pomiarowej. Można je zasadniczo wykonywać w każdej standardowo wy­posażonej pracowni diagnostycznej. Ostatni etap w metodzie enzymoim­munologicznej to pomiar aktywności enzymu użytego jako znacznika, któ­rym najczęściej jest peroksydaza. Należy uwzględnić możliwość wpływu szeregu czynników interferujących w pomiarach aktywności enzyma­tycznej tak fizycznych (np. temperatura, światło), jak i chemicznych (in­hibitory, aktywatory). Przy pomiarach spektrofotometrycznych aktyw­ności enzymu czynniki te w znacznym stopniu mogą wpływać na jakość wyników.

Wydaje się, że metody radioimmunologiczne oznaczania stężenia kwaś­nej fosfatazy sterczowej stanowią pewnego typu metody referencyjne, natomiast metody enzymoimmunologiczne, zwłaszcza w miarę ich dosko­nalenia, powinny znaleźć szerokie zastosowanie w praktyce laboratoryj­nej.

Wnioski

1.Wyniki oznaczania stężenia PAP w surowicy krwi metodą radio- i enzymoimmunologiczną są w znacznej mierze równoważne.

2.Zaletą metody EIA jest fakt, że nie wymaga znaczników izotopo- tyce laboratoryjnej. wo-promieniotwórczych i specjalistycznej aparatury pomiarowej. Meto­da EIA oznaczania PAP powinna znaleźć szerokie zastosowanie w prak­tyce laboratoryjnej.

piśmiennictwo

  1. 1. Bauer H., Góttinger H., Grenner G., Dati F.: Enzyme immunoassay for pros-tatae-specyfic acid phosphatase (E. C. 3. 1. 3. 2.), Upoi. Res., 1981, a, 21. ? 2. Choe B. K., Rose N. R., Karol M., Ponte E. J.: Irnmunoenzyme assay human prostatae phosphatase. Prac. Soc. Exp. Biol. Med., 1979, 162, 396. ? 3. Cooper E. M., Glasham R., Robinson M. R. G., Morgen D. B., Trantnar K.: The evaluation of a new en-zyme immunoassay for the measurement of prostatic acid phosphatase. Clin. Chim. Acta, 1981, 113, 27. ? 4. Fishman W. H., Lerner F.: A method for estimatig serum acid phosphatase of prostatic origin. J. Biol. Chem., 1953, 200, 89. ? 5. Foti A. G., Herschman H., Cooper J. F.: A solid phase radiioimimunoassay for human prosta­tic acid phosphatase. Cancer Res., 1975, 35, 2446. ? 6. Góttinger H.: Diagnostik und Therapie des Rrostaitafeairizinam. Karger, Basel, 1979. ? 7. Grahack J. T., Lee C, Kolbusz W., Oliver L.: Detection of carcinoma of the prostatae utilzing bioche­mical observations. Cancer, 1980, 45, 1896. ? 8. Grenner G.: Determination of pro­static acid phosphatase (PAP) by enzyme immunoassay. Clin. Chem., 1980, 26, 987. ? 9. Griffiths J. C: Prostate-specific acid phosphatase: Re-evaluation of radioimmu­noassay in diagnosing prostatic disease. Clin. Chem., 1980, 26, 433. ? 10. Gutman A. B., Gutman E. B.: An ?acid" phosphatase occuring in the serum of patients with metastasizing carcinoma of the prostate gland. J. Clin. Invest., 1938, 17, 473. 11. Jacobi G. H., Kurth K. H., Boos J., Dennebaum R.: Stellerwert der Kno-chenmairkphospbatasen als ?Staging" beim Prostatakarzinom. Verh. Dt. Ges. Urol., Springer, Berlin, 1979. ? 12. Jacobi G. H., Ehrenthal W., Prellwitz W., Grimm D? Engelmann U., Riedmiller H.: Die Bedeutung der Kanzentrationsbestimmung der sauren Phosphatase in Serum und Knochenmark bei Patienten mit Prostatakarzi-nom anhand der radioimmunologischein und enzyraimmunologischen Methode. Vehr. Dt. Ges. Urol., Springer, Berlin, 1981. ? 13. Kiesling Jr., V., Watson R. A.: A clo-ser look at serum prostatic acid phosphatase as screening test. Urology, 1980, 16, 242. ? 14. Marczyńska A., Kulpa J., Adamczyk B., Leńko J.: Kwaśna fosfataza surowicy krwi oznaczana metodą radioimmunochemiczną (PAP ? RIA): ocena wartości diagnostycznej u chorych na raka stercza. Przeg. Lek., 1982, 39, 573. ? 15. Murphy G. P., Karr J., Chu T. M.: Prostatic acid phosphatase: where are you? CA-A Cancer J. f. Clin., 1978, 28, 259. ? 16. Shulman S., Mamrod L., Gonder M. J, Soanes W. A.: The detection of prostatic acid phosphatase by antibody reaction in gel diffusion. J. Immunol., 1964, 93, 474. ? 17. Whitmore W. F.: The natural history of prostatic cancer. Cancer, 1973, 32, 1104. ? 18. Wolf Th., Kansze G., Has-sel J. P., Rutishauser G.: Der derzeitige Stellenwert der radiOTmmunologischen Bestimmung (RIA) der sauren Pnostateiphosphaitase in der Beurteiliung des Prosta-takarzinoms. Helv. Chir. Acta, 1981, 48, 445. ? 19. Woolf Ch. M.: Statistics for bio­logists. Principles of biometry. D. van Nostrand, Toronto, London, Melbourne, 1968. ? 20. Yam L. T.: Clinical significance of the human acid phosphatases: a review. Amer. J. Med., 1974, 56, 604.