IMMUNOENZYMATYCZNA METODA OZNACZANIA AKTYWNOŚCI FOSFATAZY STERCZOWEJ W SUROWICY KRWI
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1985/38/4.

autorzy

Izydor Apostoł, Maciej Augustyn, Radosława Kuciel, Jan Kulpa, Ewa Wasylewska, Jan Leńko, Antonina Marczyńska, Włodzimierz Stanisław Ostrowski: Z Instytutu Biochemii Lekarskiej AM w Krakowie
Dyrektor Instytutu: prof. dr med. W. S. Ostrowski
Z Katedry i Kliniki Urologii AM w Krakowie
Kierownik: prof. dr med. J. Leńko Z Zakładu Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii Instytutu Oddział w Krakowie
Kierownik Zakładu: prof. dr med. A. Marczyńska
Dyrektor Centrum Onkologii Instytutu Oddział w Krakowie:
p. o. prof. dr med. A. Marczyńska

streszczenie

Przedstawiono własną, prostą immunoenzymatyczną metodę oznaczania aktywności kwaśnej fosfatazy sterczowej w surowicy. Metoda ta opiera się na pomiarze aktywności izoenzymu sterczowego wyizolowanego z badanego materiału przy użyciu swoistego przeciwciała. Przy zastosowaniu tej metody wykonano oznaczenia w pilotowej grupie 57 mężczyzn, obejmującej zdrowych oraz chorych na gruczolaka i raka stercza.

Oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy w surowicy krwi jest od kilkudziesięciu lat testem pomocniczym w rozpoznawaniu i kontroli leczenia chorych na raka stercza. Terminem ?kwaśna fosfataza" określa się grupę fosfohydrolaz, które katalizują w środowisku kwaśnym reakcję hydrolizy estrów fosforanowych, pochodnych alkoholi lub fenoli, używanych jako syntetyczne substraty do oznaczania aktywności tych enzymów. ?Kwaśne fosfatazy" surowicy pochodzą z tkanki stercza, z erytrocytów, leukocytów, płytek krwi, wątroby i innych tkanek (1, 2). Podwyższenie aktywności enzymatycznej może więc być spowodowane zmianami w innych narządach niż stercz. Wprowadzenie metod immunologicznych do praktyki laboratoryjnej pozwoliło wybiórczo określić zawartość fosfatazy pochodzenia sterczowego w surowicy krwi. Spośród wielu opisywanych metod immunologicznego oznaczania zawartości fosfatazy sterczowej na szczególną uwagę zasługują, ze względu na swoją przydatność w badaniach rutynowych, metody radio- i enzymologiczne a także metody immunoenzymatyczne (RIA, EIA ? 1, 5, 7, 11, 19, 20). Stosowanie metod izotopowych, jakkolwiek uznawanych obecnie za metody referencyjne, jest dość skomplikowane, wymaga odpowiedniego przygotowania odczynników, pracowni izotopowej i kosztownej aparatury pomiarowej. Metody enzymoimmunologiczne nie wymagają tak specjalistycznej aparatury pomiarowej, ale preparatyka odczynników jest równie złożona, a procedura wykonawcza wieloetapowa.

Ponadto w praktyce laboratoryjnej przy badaniach fosfatazy sterczowej zarówno metodami RIA jak i EIA korzysta się zazwyczaj z gotowych zestawów odczynnikowych, a te nie są produkowane w Polsce. Metody immunoenzymatyczne są stosunkowo proste w wykonawstwie, a równocześnie koszt jednostkowy oznaczenia jest znacznie niższy. Fosfataza sterczowa w kompleksie ze swoistym przeciwciałem zachowuje aktywność katalityczną, co pozwala, po wprowadzeniu substratu, ocenić ilościowo zawartość enzymu w tym kompleksie (6). Czułość metody immunoenzymatyczne] jest zbliżona do czułości metod radio- i enzymoimmu-nologicznych (2, 9), a procedura oznaczania jest prosta i możliwa do przeprowadzenia w standardowo wyposażonym laboratorium klinicznym.

Przedmiotem niniejszej pracy jest opis własnej immunoenzymatycznej metody oznaczania aktywności w osoczu kwaśnej fosfatazy sterczowej oraz przedstawienie wyników w pilotowym materiale mężczyzn zdrowych oraz chorych na raka i gruczolak stercza.

METODY I MATERIAŁ

Oczyszczony preparat fosfatazy sterczowej otrzymywano wg metody Ostrowskiego (13) z usuwanych operacyjnie gruczolaków stercza. Im-munizację królików rasy nowozelandzkiej białej przeprowadzono przez iniekcję roztworu zawierającego 1 mg oczyszczonej fosfatazy sterczowej w kompletnym adiuwancie Freunda (DIFCO). Po 4 tygodniach wprowadzono taką samą dawkę przypominającą antygen w niekompletnym adiuwancie Freunda (DIFCO). Immunoprecypitację kompleksu fosfatazy sterczowej z przeciwciałem surowicy króliczej przeprowadzono w 1,0% agarozie wg metody Ouchterlony (14). Precypitat kompleksu barwiono błękitem Coomasie (15).

I. Procedura immunoenzymatycznej metody oznaczania zawartości fosfatazy pochodzenia sterczowego w surowicy krwi ludzkiej.

a. Odczynniki: przeciwciało I (Ab I) stanowi 100-krotnie rozcieńczona solą fizjologiczną surowica królika immunizowanego fosfatazą sterczową, stabilizowana 0,02% azydkiem sodu. Przeciwciało II (Ab II) stanowi su rowica kozia skierowana przeciwko immunoglobulinom królika (Wytwór nia Surowic i Szczepionek), rozcieńczona 20-krotnie solą fizjologiczną z dodatkiem 3,5% (w/w) glikolu polietylenowego 6000. Jako substrat sto suje się 15,3 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu sodu (SIGMA) w 0,2 M buforze octanowym o pH 5,0.

b. Wykonanie oznaczenia: do 0,2 ml surowicy ludzkiej wprowadzono 0,2 ml przeciwciała I i po dokładnym wymieszaniu inkubowano przez noc w temp. 20°C. Następnie do każdej próbki dodawano po 1 ml prze ciwciała II. Po 60 min. inkubacji w temp. 20°C zbierano osad wytrąco nego kompleksu przez wirowanie przy 10 000 g (5 min.) i oznaczano w nim aktywność fosfatazy. Oznaczenie przeprowadzano w trzech równo ległych próbkach. Próba odnośnikowa zawierała w miejsce badanej suro wicy 0,9% roztworu chlorku sodu.

c. Oznaczanie aktywności fosfatazy: osad wytrąconego kompleksu fosfatazy sterczowej z przeciwciałem I oraz z przeciwciałem II za wieszano w 0,2 ml 0,9% chlorku sodowego i dodawano po 0,2 ml 15,3 mM p-nitrofenylofosforanu sodowego w 0,2 M buforze octanowym o pH 5,0. Enzym inkubowano z substratem przez 30 min. w temp. 37°C, a nas tępnie reakcję przerywano przez wprowadzenie 2 ml 0,1 M NaOH. Ilość powstałego produktu określano na podstawie absorpcji przy 405 nm (spektrofotometr SPECORD UV VIS) wobec próby odnośnikowej.

W warunkach przeprowadzonych oznaczeń, wartość współczynnika ?K" wynosi 23, czyli aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy obliczano ze wzoru:

U/L+AA405X23

II. Materiał: oznaczanie aktywności fosfatazy pochodzenia sterczowego przeprowadzono w trzech grupach mężczyzn. Krew do badania pobierano na czczo w warunkach standardowych. Grupa I składała się z 18 zdrowych mężczyzn w wieku od 30 do 40 lat. Stanowili oni grupę porównawczą, która pozwoliła ustalić średnią wartość aktywności fosfatazy sterczowej w surowicy zdrowych mężczyzn.

Grupa II objęła 27 chorych na gruczolak stercza. Wiek chorych wahał się od 54 do 81 lat (średnio 69,4 lat). Wszystkich chorych operowano, wykonując adenomektomię sposobem Millina lub rozległą, przezcewkową elektroresekcję (TUR), o ile stan ogólny chorego nie zezwalał na operację radykalną. U wszystkich chorych potwierdzono rozpoznanie gruczolaka badaniem anatomopatologicznym.

Grupa III objęła 12 chorych na raka stercza. Chorych kwalifikowano do jednej z grup klinicznego zaawansowania wg Whitmore'a (10, 20). W grupie A było 4 chorych, w grupie B 3 chorych, w grupie C ? 4 i w grupie D 1 chory. Wiek chorych wahał się od 58 do 71 lat (średnio 70,9 lat). U wszystkich chorych dokonano identyfikacji cytologicznej (Cienkoigłowe przezodbytnicze nakłucie stercza igłą Franzena) lub histopatologicznej (pobranie wycinka ze stercza na drodze przezcewkowej elektroresekcji ? TUR).

Badania mikroskopowe wykonano w Zakładzie Anatomii Patologicznej Instytutu Patologii AM (Kierownik Zakładu i Instytutu prof. dr hab. med. Anna Urban). Krew od chorych do badań pobierano w warunkach standardowych przed rozpoczęciem leczenia. Surowice zamrażano po odwirowaniu skrzepu i przechowywano do czasu oznaczenia w temp. ?20°C.

WYNIKI I DYSKUSJA

Oczyszczony, elektroforetycznie jednorodny preparat fosfatazy sterczowej, używany jako antygen do otrzymania przeciwciał, wytrąca pojedynczy łuk precypitacyjny z surowicą immunizowanego królika (ryc. 1) i nie daje reakcji krzyżowej z fosfatazą erytrocytów i płytek krwi. Na podstawie przeprowadzonego miareczkowania fosfatazy sterczowej surowicą immunizowanego królika stwierdzono, że 1 ml surowicy króliczej wiąże około 30 ?g fosfatazy sterczowej (ryc. 2). Do dalszych doświadczeń wybrano więc 100-krotne rozcieńczenie surowicy króliczej jako odpowiednie do ilościowego wytrącenia fosfatazy zawartej w 0,2 ml próbce ludzkiej surowicy. Aktywność fosfatazy sterczowej w osadzie wytrąconego kompleksu jest proporcjonalna do ilości wprowadzonego do próbki enzymu od 0 do 12 U/l (ryc. 3).

Badano również wpływ warunków przechowywania surowicy pobranej od chorych na wyniki oznaczeń aktywności fosfatazy. Surowice chorych o różnej zawartości fosfatazy sterczowej przechowywano przez okres jednego do czterech tygodni w temperaturze ?20°C. Po rozmrożeniu oznaczano w surowicy aktywność fosfatazy i ponownie je zamrażano. Postępowanie to powtarzano trzykrotnie (ryc. 4). Przeprowadzone doświadczenia wskazują, że badany enzym cechuje się małą stabilnością aktywności katalitycznej, a jednocześnie kilkakrotne zamrażanie i odmrażanie powoduje wytrącenie się białek surowicy, w tym również i fosfataz pochodzących z innych narządów. Próbę aktywności należy więc przeprowadzać w surowicy krwi świeżo pobranej od badanego, bądź przechowywać, bez rozmrażania, do czasu wykonania oznaczenia w temp. ?20°C.

Wartość średnia aktywności fosfatazy sterczowej dla grupy kontrolnej zdrowych mężczyzn wynosi 0,66 ? 0,72 U/l. Na tej podstawie przyjęto za prawidłową aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy krwi wartości nie przekraczające 1,38 U/l. W grupie chorych na gruczolak stercza aktywność u 22 spośród 27 badanych kształtowała się w zakresie normy a u pozostałych 5 chorych wykazała miernego stopnia podwyższenie. U 50% badanych, tj. u 6 chorych na raka stercza stwierdzono podwyższoną aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy krwi, w tym u jednego chorego w stadium A, u 2 w stadium B, u 2 w stadium C i u 1 w stadium D. U trzech chorych aktywności były znacznie podwyższone (ryc. 5).

Obserwowana przez nas grupa chorych była zbyt mała, aby można było rozważać jakąś zależność pomiędzy stopniem zaawansowania nowotworu a poziomem fosfatazy sterczowej w surowicy krwi. Badania własne jak i przedstawione w piśmiennictwie, przeprowadzane w dużych grupach chorych, przy zastosowaniu metod immunochemicznych, wskazują na istnienie pewnej zależności pomiędzy stopniem zaawansowania klinicznego, a aktywnością lub stężeniem fosfatazy sterczowej w surowicy krwi badanych. W zależności od składu klinicznego chorych u 40,0? 70,0% badanych stwierdza się podwyższony poziom fosfatazy sterczowej, przy czym wyższe odsetki dotyczą chorych w stadium D (do 90,0%), a niższe u chorych o mniejszym zaawansowaniu klinicznym.

Z klinicznego punktu widzenia wysuwają się szczególnie dwa aspekty przydatności oznaczeń kwaśnej fosfatazy sterczowej, tj. we wczesnej diagnostyce oraz w monitorowaniu leczenia chorych na raka stercza. Dzięki wprowadzeniu metod radio- i enzymoimmunologicznych użyteczność oznaczeń stężenia tego enzymu dla monitorowania leczenia chorych na raka stercza jest w pełni uznawana. Wyniki wielokrotnie powtarzanych w toku leczenia oznaczeń stanowią dobry zespół wskaźników dla oceny efektywności terapii. Natomiast przydatność oznaczeń kwaśnej fosfatazy sterczowej we wczesnej diagnostyce jest przedmiotem licznych dyskusji i badań, szczególnie w aspekcie różnicowania chorych na raka stercza w stadium A zaawansowania klinicznego i chorych na gruczolak stercza. Podwyższony poziom enzymu w zależności od metody i autora, u chorych w stadium A waha się od 0 do 50,0%, a u chorych na gruczolak stercza, jakkolwiek miernego stopnia, podwyższenie poziomu fosfatazy sterczowej obserwowano od 0 do 30,0% (11). Również w prezentowanej metodzie w badaniach pilotowej grupy chorych na gruczolak stercza obserwowaliśmy podwyższony poziom aktywności fosfatazy sterczowej u 19,0% badanych.

Ujemną stroną oznaczeń poziomu fosfatazy sterczowej metodami RIA i EIA, poza wymienionymi już we wstępie ograniczeniami narzucanymi przez stosowanie izotopów promieniotwórczych, jest konieczność prowadzenia badań w dużych seriach m. in. ze względu na wykonywanie dla każdej serii oznaczeń krzywej wzorcowej. Wydłuża to czas uzyskiwania wyniku dla poszczególnego chorego w związku z koniecznością zgromadzenia odpowiedniej liczby próbek do badań. Wykonywanie badań tymi metodami z odpowiednią częstotliwością jest zatem możliwe jedynie w dużych ośrodkach klinicznych. Zaletą prezentowanej przez nas metody jest możliwość, przy odpowiednim rozdozowaniu odczynników, wykonywania oznaczeń w małych seriach.

piśmiennictwo