PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

IMMUNOENZYMATYCZNA METODA OZNACZANIA AKTYWNOŚCI FOSFATAZY STERCZOWEJ W SUROWICY KRWI
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1985/38/4.

autorzy

Izydor Apostoł, Maciej Augustyn, Radosława Kuciel, Jan Kulpa, Ewa Wasylewska, Jan Leńko, Antonina Marczyńska, Włodzimierz Stanisław Ostrowski
Z Instytutu Biochemii Lekarskiej AM w Krakowie
Dyrektor Instytutu: prof. dr med. W. S. Ostrowski
Z Katedry i Kliniki Urologii AM w Krakowie
Kierownik: prof. dr med. J. Leńko Z Zakładu Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii Instytutu Oddział w Krakowie
Kierownik Zakładu: prof. dr med. A. Marczyńska
Dyrektor Centrum Onkologii Instytutu Oddział w Krakowie:
p. o. prof. dr med. A. Marczyńska

streszczenie

Przedstawiono własną, prostą immunoenzymatyczną metodę ozna­czania aktywności kwaśnej fosfatazy sterczowej w surowicy. Metoda ta opiera się na pomiarze aktywności izoenzymu sterczowego wyizolowa­nego z badanego materiału przy użyciu swoistego przeciwciała. Przy zastosowaniu tej metody wykonano oznaczenia w pilotowej grupie 57 mężczyzn, obejmującej zdrowych oraz chorych na gruczolaka i raka stercza.

Oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy w surowicy krwi jest od kilkudziesięciu lat testem pomocniczym w rozpoznawaniu i kontroli le­czenia chorych na raka stercza. Terminem ?kwaśna fosfataza" określa się grupę fosfohydrolaz, które katalizują w środowisku kwaśnym re­akcję hydrolizy estrów fosforanowych, pochodnych alkoholi lub fenoli, używanych jako syntetyczne substraty do oznaczania aktywności tych enzymów. ?Kwaśne fosfatazy" surowicy pochodzą z tkanki stercza, z ery­trocytów, leukocytów, płytek krwi, wątroby i innych tkanek (1, 2). Pod­wyższenie aktywności enzymatycznej może więc być spowodowane zmia­nami w innych narządach niż stercz. Wprowadzenie metod immunologicz­nych do praktyki laboratoryjnej pozwoliło wybiórczo określić zawartość fosfatazy pochodzenia sterczowego w surowicy krwi. Spośród wielu opi­sywanych metod immunologicznego oznaczania zawartości fosfatazy ster­czowej na szczególną uwagę zasługują, ze względu na swoją przydatność w badaniach rutynowych, metody radio- i enzymologiczne a także me­tody immunoenzymatyczne (RIA, EIA ? 1, 5, 7, 11, 19, 20). Stosowanie metod izotopowych, jakkolwiek uznawanych obecnie za metody referen­cyjne, jest dość skomplikowane, wymaga odpowiedniego przygotowania odczynników, pracowni izotopowej i kosztownej aparatury pomiarowej. Metody enzymoimmunologiczne nie wymagają tak specjalistycznej apara­tury pomiarowej, ale preparatyka odczynników jest równie złożona, a procedura wykonawcza wieloetapowa.

Ponadto w praktyce laboratoryjnej przy badaniach fosfatazy sterczo­wej zarówno metodami RIA jak i EIA korzysta się zazwyczaj z gotowych zestawów odczynnikowych, a te nie są produkowane w Polsce. Me­tody immunoenzymatyczne są stosunkowo proste w wykonawstwie, a rów­nocześnie koszt jednostkowy oznaczenia jest znacznie niższy. Fosfataza sterczowa w kompleksie ze swoistym przeciwciałem zachowuje aktyw­ność katalityczną, co pozwala, po wprowadzeniu substratu, ocenić iloś­ciowo zawartość enzymu w tym kompleksie (6). Czułość metody immu­noenzymatyczne] jest zbliżona do czułości metod radio- i enzymoimmu-nologicznych (2, 9), a procedura oznaczania jest prosta i możliwa do prze­prowadzenia w standardowo wyposażonym laboratorium klinicznym.

Przedmiotem niniejszej pracy jest opis własnej immunoenzymatycznej metody oznaczania aktywności w osoczu kwaśnej fosfatazy sterczowej oraz przedstawienie wyników w pilotowym materiale mężczyzn zdrowych oraz chorych na raka i gruczolak stercza.

METODY I MATERIAŁ

Oczyszczony preparat fosfatazy sterczowej otrzymywano wg metody Ostrowskiego (13) z usuwanych operacyjnie gruczolaków stercza. Im-munizację królików rasy nowozelandzkiej białej przeprowadzono przez iniekcję roztworu zawierającego 1 mg oczyszczonej fosfatazy sterczowej w kompletnym adiuwancie Freunda (DIFCO). Po 4 tygodniach wprowa­dzono taką samą dawkę przypominającą antygen w niekompletnym adiuwancie Freunda (DIFCO). Immunoprecypitację kompleksu fosfatazy sterczowej z przeciwciałem surowicy króliczej przeprowadzono w 1,0% agarozie wg metody Ouchterlony (14). Precypitat kompleksu barwiono błękitem Coomasie (15).

I. Procedura immunoenzymatycznej metody oznaczania zawartości fo­sfatazy pochodzenia sterczowego w surowicy krwi ludzkiej.

a. Odczynniki: przeciwciało I (Ab I) stanowi 100-krotnie rozcieńczona solą fizjologiczną surowica królika immunizowanego fosfatazą sterczową, stabilizowana 0,02% azydkiem sodu. Przeciwciało II (Ab II) stanowi su­ rowica kozia skierowana przeciwko immunoglobulinom królika (Wytwór­ nia Surowic i Szczepionek), rozcieńczona 20-krotnie solą fizjologiczną z dodatkiem 3,5% (w/w) glikolu polietylenowego 6000. Jako substrat sto­ suje się 15,3 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu sodu (SIGMA) w 0,2 M buforze octanowym o pH 5,0.

b. Wykonanie oznaczenia: do 0,2 ml surowicy ludzkiej wprowadzono 0,2 ml przeciwciała I i po dokładnym wymieszaniu inkubowano przez noc w temp. 20°C. Następnie do każdej próbki dodawano po 1 ml prze­ ciwciała II. Po 60 min. inkubacji w temp. 20°C zbierano osad wytrąco­ nego kompleksu przez wirowanie przy 10 000 g (5 min.) i oznaczano w nim aktywność fosfatazy. Oznaczenie przeprowadzano w trzech równo­ ległych próbkach. Próba odnośnikowa zawierała w miejsce badanej suro­ wicy 0,9% roztworu chlorku sodu.

c. Oznaczanie aktywności fosfatazy: osad wytrąconego kompleksu fosfatazy sterczowej z przeciwciałem I oraz z przeciwciałem II za­ wieszano w 0,2 ml 0,9% chlorku sodowego i dodawano po 0,2 ml 15,3 mM p-nitrofenylofosforanu sodowego w 0,2 M buforze octanowym o pH 5,0. Enzym inkubowano z substratem przez 30 min. w temp. 37°C, a nas­ tępnie reakcję przerywano przez wprowadzenie 2 ml 0,1 M NaOH. Ilość powstałego produktu określano na podstawie absorpcji przy 405 nm (spektrofotometr SPECORD UV VIS) wobec próby odnośnikowej.

W warunkach przeprowadzonych oznaczeń, wartość współczynnika ?K" wynosi 23, czyli aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy obli­czano ze wzoru:

U/L+AA405X23

II. Materiał: oznaczanie aktywności fosfatazy pochodzenia sterczo­wego przeprowadzono w trzech grupach mężczyzn. Krew do badania po­bierano na czczo w warunkach standardowych. Grupa I składała się z 18 zdrowych mężczyzn w wieku od 30 do 40 lat. Stanowili oni grupę po­równawczą, która pozwoliła ustalić średnią wartość aktywności fosfa­tazy sterczowej w surowicy zdrowych mężczyzn.

Grupa II objęła 27 chorych na gruczolak stercza. Wiek chorych wa­hał się od 54 do 81 lat (średnio 69,4 lat). Wszystkich chorych operowano, wykonując adenomektomię sposobem Millina lub rozległą, przezcewkową elektroresekcję (TUR), o ile stan ogólny chorego nie zezwalał na ope­rację radykalną. U wszystkich chorych potwierdzono rozpoznanie gru­czolaka badaniem anatomopatologicznym.

Grupa III objęła 12 chorych na raka stercza. Chorych kwalifikowano do jednej z grup klinicznego zaawansowania wg Whitmore'a (10, 20). W grupie A było 4 chorych, w grupie B 3 chorych, w grupie C ? 4 i w grupie D 1 chory. Wiek chorych wahał się od 58 do 71 lat (średnio 70,9 lat). U wszystkich chorych dokonano identyfikacji cytologicznej (Cienko­igłowe przezodbytnicze nakłucie stercza igłą Franzena) lub histopatolo­gicznej (pobranie wycinka ze stercza na drodze przezcewkowej elektrore­sekcji ? TUR).

Badania mikroskopowe wykonano w Zakładzie Anatomii Patologicznej Instytutu Patologii AM (Kierownik Zakładu i Instytutu prof. dr hab. med. Anna Urban). Krew od chorych do badań pobierano w warunkach stan­dardowych przed rozpoczęciem leczenia. Surowice zamrażano po odwi­rowaniu skrzepu i przechowywano do czasu oznaczenia w temp. ?20°C.

WYNIKI I DYSKUSJA

Oczyszczony, elektroforetycznie jednorodny preparat fosfatazy ster­czowej, używany jako antygen do otrzymania przeciwciał, wytrąca po­jedynczy łuk precypitacyjny z surowicą immunizowanego królika (ryc. 1) i nie daje reakcji krzyżowej z fosfatazą erytrocytów i płytek krwi. Na podstawie przeprowadzonego miareczkowania fosfatazy sterczowej suro­wicą immunizowanego królika stwierdzono, że 1 ml surowicy króliczej wiąże około 30 ?g fosfatazy sterczowej (ryc. 2). Do dalszych doświadczeń wybrano więc 100-krotne rozcieńczenie surowicy króliczej jako odpowied­nie do ilościowego wytrącenia fosfatazy zawartej w 0,2 ml próbce ludz­kiej surowicy. Aktywność fosfatazy sterczowej w osadzie wytrąconego kompleksu jest proporcjonalna do ilości wprowadzonego do próbki en­zymu od 0 do 12 U/l (ryc. 3).

Badano również wpływ warunków przechowywania surowicy pobranej od chorych na wyniki oznaczeń aktywności fosfatazy. Surowice chorych o różnej zawartości fosfatazy sterczowej przechowywano przez okres jednego do czterech tygodni w temperaturze ?20°C. Po rozmrożeniu ozna­czano w surowicy aktywność fosfatazy i ponownie je zamrażano. Postę­powanie to powtarzano trzykrotnie (ryc. 4). Przeprowadzone doświadcze­nia wskazują, że badany enzym cechuje się małą stabilnością aktywności katalitycznej, a jednocześnie kilkakrotne zamrażanie i odmrażanie powo­duje wytrącenie się białek surowicy, w tym również i fosfataz pocho­dzących z innych narządów. Próbę aktywności należy więc przeprowa­dzać w surowicy krwi świeżo pobranej od badanego, bądź przechowywać, bez rozmrażania, do czasu wykonania oznaczenia w temp. ?20°C.

Wartość średnia aktywności fosfatazy sterczowej dla grupy kontrol­nej zdrowych mężczyzn wynosi 0,66 ? 0,72 U/l. Na tej podstawie przy­jęto za prawidłową aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy krwi wartości nie przekraczające 1,38 U/l. W grupie chorych na gruczolak stercza aktywność u 22 spośród 27 badanych kształtowała się w zakre­sie normy a u pozostałych 5 chorych wykazała miernego stopnia pod­wyższenie. U 50% badanych, tj. u 6 chorych na raka stercza stwierdzono podwyższoną aktywność fosfatazy sterczowej w surowicy krwi, w tym u jednego chorego w stadium A, u 2 w stadium B, u 2 w stadium C i u 1 w stadium D. U trzech chorych aktywności były znacznie podwyższone (ryc. 5).

Obserwowana przez nas grupa chorych była zbyt mała, aby można było rozważać jakąś zależność pomiędzy stopniem zaawansowania nowotworu a poziomem fosfatazy sterczowej w surowicy krwi. Badania własne jak i przedstawione w piśmiennictwie, przeprowadzane w dużych grupach chorych, przy zastosowaniu metod immunochemicznych, wska­zują na istnienie pewnej zależności pomiędzy stopniem zaawansowania klinicznego, a aktywnością lub stężeniem fosfatazy sterczowej w suro­wicy krwi badanych. W zależności od składu klinicznego chorych u 40,0? 70,0% badanych stwierdza się podwyższony poziom fosfatazy sterczowej, przy czym wyższe odsetki dotyczą chorych w stadium D (do 90,0%), a niższe u chorych o mniejszym zaawansowaniu klinicznym.

Z klinicznego punktu widzenia wysuwają się szczególnie dwa aspek­ty przydatności oznaczeń kwaśnej fosfatazy sterczowej, tj. we wczesnej diagnostyce oraz w monitorowaniu leczenia chorych na raka stercza. Dzię­ki wprowadzeniu metod radio- i enzymoimmunologicznych użyteczność oznaczeń stężenia tego enzymu dla monitorowania leczenia chorych na raka stercza jest w pełni uznawana. Wyniki wielokrotnie powtarzanych w toku leczenia oznaczeń stanowią dobry zespół wskaźników dla oceny efektywności terapii. Natomiast przydatność oznaczeń kwaśnej fosfatazy sterczowej we wczesnej diagnostyce jest przedmiotem licznych dyskusji i badań, szczególnie w aspekcie różnicowania chorych na raka stercza w stadium A zaawansowania klinicznego i chorych na gruczolak stercza. Podwyższony poziom enzymu w zależności od metody i autora, u chorych w stadium A waha się od 0 do 50,0%, a u chorych na gruczolak stercza, jakkolwiek miernego stopnia, podwyższenie poziomu fosfatazy sterczowej obserwowano od 0 do 30,0% (11). Również w prezentowanej metodzie w badaniach pilotowej grupy chorych na gruczolak stercza obserwowaliś­my podwyższony poziom aktywności fosfatazy sterczowej u 19,0% bada­nych.

Ujemną stroną oznaczeń poziomu fosfatazy sterczowej metodami RIA i EIA, poza wymienionymi już we wstępie ograniczeniami narzucanymi przez stosowanie izotopów promieniotwórczych, jest konieczność prowa­dzenia badań w dużych seriach m. in. ze względu na wykonywanie dla każdej serii oznaczeń krzywej wzorcowej. Wydłuża to czas uzyskiwania wyniku dla poszczególnego chorego w związku z koniecznością zgroma­dzenia odpowiedniej liczby próbek do badań. Wykonywanie badań tymi metodami z odpowiednią częstotliwością jest zatem możliwe jedynie w dużych ośrodkach klinicznych. Zaletą prezentowanej przez nas metody jest możliwość, przy odpowiednim rozdozowaniu odczynników, wykony­wania oznaczeń w małych seriach.

piśmiennictwo

  1. 1. Choe B. K., Pontes E. J., Dong U. K., Rose N. R.: Double ? antibody immunoenzyme assay for human prostatic acid phosphatase. Clin. Chem., 1980, 26, 1854. ? 2. Choe B. H., Rose N. R.: Prostatic acid phosphatase: A marker for human prostatic adenocarcinoma. Methods in Cancer Research, 1982, XIX, 199. ? 3. Cooper J. F., Foti A.: A radioimmunoassay for prostatic acid phosphatase. In-vest. Urol., 1974, 12, 98. ? 4. Cooper E. H., Glasham R., Robinson M. R. G., Morgan D. B., Trautner K.: The evaluation of a new enzymoimmunoassay for the measurement of prostatic acid phosphatase. Clin. Chim. Acta, 1981, 118, 27. ? 5. Davies S. N., Grifiths J. C.t Prostate specific acid phosphatase: further studies with immunological techniąues. Clin. Chim. Acta, 1982, 122, 29. ? 6. Foti A., Herschman H., Cooper J. F.: Comparison of human prostatic acid phosphatase by measurement of enzymatic activity and by radioimmunoassay. Clin. Chem., 1977, 23, 95. ? 7. Gericke K., Kohse K., Pfleiderer G., Flutcher S., Bichler K.: De-velopment and evaluation of new solid-phase direct immunoenzyme assay for pros­tatic acid phosphatase. Clin. Chem., 1982, 28, 596. ? 8. Griffiths J., Rippe D. F., Panfili P. R.: Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and radioim­munoassay for prostate specific acid phosphatase in prostatic disease. Clin. Chem., 1982, 28, 183. ? 9. Kulpa J., Kwinta A.; Kwaśna fosfataza sterczowa (PAP) w osoczu ? porównanie metody radio- i enzymoimmunologicznego oznaczania stę­żenia. Urol. Pol., 1985, 38, 55. ? 10. Leńko J.: Rak stercza. Urol. Pol. 1984, 37, 245.
  2. 11. Marczyńska A., Kulpa J., Adamczyk B., Leńko J.: Kwaśna fosfataza su­rowicy krwi oznaczana metodą radioimmunochemiczną (PAP-RIA); Ocena war­tości diagnostycznej u chorych na raka stercza. Przeg. Lek., 1982, 39, 573. ? 12. Marczyńska A., Kulpa J., Leńko J., Stefański W.: Antygen karcinoembrionalny (CEA) osocza w konfrontacji z kwaśną fosfatazą sterczową (PAP-RIA) u cho­rych na nowotwory stercza. Urol. Pol., 1983, 36, 195. ? 13. Ostrowski W.: Further characterisation of acid phosphomonoesterase of human prostate. Acta Biochem. Pol., 1968, 15, 213. ? 14. Ouchterlony O., Nilsson L. A.: Immunodiffusion and immunoelectrophoresis w Handbook of Experimental Immunology, vol. 1., D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, 1973, 191. ? 15. Ouchterlony O., Nilsson L. A.: Immunodiffusion and immunoelectrophore-się w Handbook of Experimental Immunology. vol. 1., D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinbourgh, 1978, 19, l. ? 16. Pappas A., Gadsden R. H.: Prostatic acid phosphatase in detection, assesment and monitoring: cli­nical utility carcinoma of the prostate. Ann. Clin. Lab. Sci., 1984,14, 285. ?17. Quinones G. R., Rohner T. J., Drago J., Rand Demers L. M.: Will prostatic acid phosphatase de­termination by radioimmunoassay increase the diagnosis of early prostatic can­cer? J. Urol., 1981, 125, 361. ? 18. Schwartz M. K., Fleischer M., Bodansky O.; Clinical applications of phosphohydrolase measurement of cancer. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1969, 166, 775. ? 19. Vikho P., Lukkarinen P., Kontturi M., Vikho R.: Effec-tiveness of radioimmunoassay of human Prostate-specific acid phosphatase in the diagnosis and follow-up of therapy in prostatic carcinoma. Cancer Res., 1981, 41, 1180. ? 20. Vikho P., Sajanti E., Jaune O., Peltonen L., Vikho R.: Serum Pros­tate-specific acid phosphatase: Development and validation of a specific radio­immunoassay. Clin. Chem., 1978, 24, 1915.
  3. 21. Yam L. T.: Clinical significance of the human acid phosphatase. Am. J. Med., 1974, 56, 606.