english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Wprowadzenie

Ostre, niepowikłane infekcje dróg moczowych (UTI ? urinary tract infection) są najczęstszą formą pozaszpitalnych zakażeń występujących u kobiet, szczególnie młodych (powyżej jednego epizodu w ciągu sześciu miesięcy). Większość UTI występuje w postaci sporadycznych zapaleń pęcherza, ale aż 25-50% kobiet cierpi na wielokrotne nawroty tej choroby [1]. Kobiety z ostrymi i nawrotowymi zapaleniami dróg moczowych zakażone są w większości przypadków tzw. uropatogennymi szczepami Escherichia coli (UPEC) [2]. Pałeczki te mają zdolność do kolonizacji i zakażania dróg moczowych między innymi dzięki wytwarzanym powierzchniowym czynnikom wirulencji, warunkującym możliwość ich przyłączenia się do specyficznych receptorowych cząsteczek obecnych na komórce gospodarza. Do tych czynników wirulencji zalicza się przede wszystkim adhezyny, czyli białka fimbrialne: typu 1, P, S, oraz Dr [3,4]. Typ 1 fimbrii, spotykany najczęściej u E. coli wywołujących zapalenie pęcherza moczowego, przyjmuje formy wydłużonych, grubych włókien, będących przedłużeniem otoczek polisacharydowych, dzięki którym może dochodzić do aglutynacji świeżych erytrocytów, np. świnki morskiej. Na podstawie tej reakcji przeprowadza się test hemaglutynacji wykrywający ekspresję fimbrii typu 1. Może ona być hamowana za pomocą D-mannozy i dlatego ten rodzaj adhezyn jest również nazywany mannozozależnym [5].

Szczepy E. coli izolowane z moczu w większości przypadków wykazują na swojej powierzchni również obecność fimbrii typu P, które warunkują powinowactwo tych pałeczek do glikolipidowych receptorów (zawierających cząsteczki aGal-b-(1-4)-Gal), występujących na powierzchni tkanki wyścielającej drogi moczowe gospodarza.

Innymi typami fimbrii, związanymi z UPEC, są fimbrie S i F1C, które należą do tej samej rodziny adhezyn kodowanej przez geny sfa i foc. Wiążą się z wieloma strukturami komórek układu moczowego. Natomiast adhezyny typu Dr (kodowane przez geny afa1 i afa2), które są cechą pewnej grupy UPEC, powodują UTI u ciężarnych kobiet. Rozpoznają one bowiem czynnik DAF (DAF ? decay accelerating factor), składnik antygenu grupowego krwinek Dr, związany z regulacją kaskady dopełniacza, a eksponowany pod wpływem hormonów ciążowych [6].

Uropatogennne szczepy E. coli pochodzą głównie z przewodu pokarmowego gospodarza, a w przypadku kobiet, również pośrednio z pochwy [7]. Namnażanie się E. coli na nabłonku pochwy i jej ujścia, utrzymujące się przez dłuższy okres, prowadzi w konsekwencji do kolonizacji, a następnie infekcji dróg moczowych [8]. Czasami taka kolonizacja doprowadza także do specyficznego zakażenia pochwy, tzw. tlenowego, bakteryjnego zapalenia pochwy.

Tlenowe, bakteryjne zapalenie pochwy jest niedawno wydzieloną jednostką chorobową, charakteryzującą się ostrymi objawami zapalnymi z obfitym naciekiem leukocytarnym w nabłonku pochwy. W odróżnieniu od wcześniej poznanej bakteryjnej waginozy, związanej z przerostem beztlenowej mikroflory pochwy, tlenowe zapalenie pochwy jest wynikiem niekontrolowanego przerostu tlenowych, bakteryjnych składników flory pochwy, takich jak E. coli i/lub Enterococcus faecalis czy Streptococcus agalactiae [9,10].

Większość genów warunkujących obecność fimbrii na powierzchni komórki bakteryjnej kodowana jest przez chromosomalne DNA lub rzadziej przez plazmidowe DNA. Fimbrie mogą ujawniać się pod wpływem stymulującego działania warunków hodowlanych bakterii (czas, pasaż, temperatura, obecność antybiotyku), a ponadto wspomina się również o możliwości wywierania wpływu na tworzenie się struktur fimbrialnych na powierzchni komórki bakteryjnej przez inne współżyjące w jednym środowisku bakterie [11]. Można powiedzieć, że typ fimbrii warunkuje zasiedlanie przez bakterie określonej niszy. Wykazano, że wśród bakterii wywołujących zapalenie pęcherza moczowego przeważają szczepy mające fimbrie typu 1, zaś obecność fimbrii typu P stwierdzono głównie u szczepów E. coli izolowanych z moczu i dlatego uważa się, że obecność fimbrii typu P zwiększa powinowactwo tych szczepów do nabłonka dróg moczowych. Ponadto znacznie wyższy stopień adhezji wykazują te szczepy E. coli, które posiadają mieszane formy fimbrii.

Możliwość udziału szczepów E. coli w zakażeniach zarówno dróg rodnych, jak i moczowych nasuwa pytanie, czy pałeczki te nie posiadają na swojej powierzchni podobnych czynników wirulencji, umożliwiających im przyleganie do nabłonka pochwy i, w równym stopniu, do nabłonka pęcherza moczowego.

Zakładając, że szczepy E. coli (powodujące zakażenia dróg moczowych u kobiet) pochodzą, między innymi z rezerwuaru, jaki stanowi mikroflora pochwy, należy zastanowić się nad możliwością ograniczania populacji tych bakterii przez stosowanie dopochwowych lub doustnych probiotyków, zawierających szczepy Lactobacillus tak dobrane, aby w sposób najbardziej aktywny hamowały wzrost E. coli [12], tym samym ograniczając ich zdolność do kolonizacji nabłonka pochwy i dróg moczowych.

Cel pracy

Porównanie powierzchniowych czynników wirulencji szczepów Escherichia coli wyizolowanych z moczu kobiet z objawami zakażenia dróg moczowych oraz z wymazów z pochwy w przypadku tlenowego, bakteryjnego zapalenia pochwy, a następnie przebadanie wrażliwości wyizolowanych szczepów E. coli na działanie wybranych bakterii z rodzaju Lactobacillus, należących do różnych gatunków kolonizujących drogi rodne zdrowych kobiet.

Materiał i metody

Materiał

Materiałem do badań były szczepy Escherichia coli wyizolowane z próbek moczu, pobranych od 25 kobiet wykazujących objawy zakażeń dróg moczowych i znamienną bakteriurię, oraz z wymazów z pochwy pobranych od 20 pacjentek z objawami tlenowego, bakteryjnego zapalenia pochwy, wykazujących wartość skali Nugenta równą lub wyższą niż 4,0. W sumie do badań wybrano osiemnaście szczepów E. coli, dziewięć z nich pochodziło z moczu i dziewięć z pochwy. Przynależność tych szczepów do gatunku E. coli stwierdzono za pomocą zestawu API 20E (bioMerieux), zaś potwierdzono genotypowo w oparciu o technikę PCR z zastosowaniem starterów dla genu ß-galaktozydazy specyficznego dla E. coli [13].

Metody

A. Porównanie właściwości powierzchniowych 18 szczepów Escherichia coli wyizolowanych z moczu i pochwy.

W tym celu posłużono się następującymi metodami:

1. Oznaczanie ekspresji fimbrii typu 1.

Testy hemaglutynacyjne wykonano zgodnie z metodą Evansa [14], używając 3% zawiesinę krwinek świnki morskiej i wołu, świeżych lub taninowanych, stosując kwas taninowy produkcji Sigma. Wrażliwość fimbrii typu 1 na mannozę oceniano w obecności 2% mannozy (metylo a?D mannopiranozyd, Sigma). Siłę aglutynacji obserwowano makroskopowo, oceniając ją w skali półilościowej w stosunku do kontroli pozytywnej (szczep E. coli ATCC-25922) i negatywnej (szczep E. coli HB 101/10-75).

2. Oznaczanie aktywności hemaglutynacyjnej adhezyn P.

Hemaglutynację przeprowadzono także według metody Evansa [14], używając 3% świeżych krwinek ludzkich grupy OP1 bez mannozy i z dodatkiem 2% mannozy. Szczepy do testu hemaglutynacyjnego z krwinkami OP1 hodowano na podłożu TSA (bioMerieux) (24 godz., 37oC), następnie zawieszano w roztworze PBS uzyskując gęstość 109 kom./ml. Odczyn wykonywano w sposób identyczny jak poprzednio opisany. Kontrolę pozytywną stanowił szczep E. coli ATCC-25922, zaś negatywną nie fimbrialny szczep 912 Klebsiella oxytoca.

3. Wykrywanie obecności genów kodujących struktury białkowe fimbrii P, S i Dr w DNA chromosomalnym E. coli.

W celu wykrycia obecności różnych genów kodujących struktury białkowe fimbrii P, S i Dr wyizolowano z badanych szczepów E. coli genomowe DNA, stosując kolumienkowy zestaw firmy DNA Gdańsk (Polska). W oparciu o zaprojektowane przez Yamamoto cztery pary starterów (tab. I), przeprowadzono reakcje multipleks PCR [15]. Ta technika pozwoliła na uzyskanie, w trakcie przebiegu jednej reakcji PCR, kilku produktów wskazujących na obecność badanych czynników wirulencji.

4. Badanie zdolności adherencyjnych szczepów E. coli do komórek linii nabłonka pochwy A-431 oraz linii nabłonka pęcherza moczowego HCV-29.

W celu oznaczenia zdolności badanych szczepów Escherichia coli (pochodzących z dróg rodnych i moczowych) do przylegania do komórek ustroju ludzkiego, posłużono się linią komórek nabłonka pochwy A-431 oraz linią nabłonka pęcherza moczowego HCV-29. Szczepy E. coli hodowano na stałym podłożu Mac Conkey?a (Biocorp) przez 18 godzin. Następnie pojedyncze kolonie zawieszano w 1 ml płynnego bulionu TSB (Difco) i hodowlę kontynuowano przez 18 godzin. Szczepy E. coli doprowadzano do gęstości 109 kom./ml świeżego bulionu TSB. Hodowlę linii prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża DMEM (IITD Wrocław, Polska) z glutaminą, wzbogaconego dodatkiem 5% inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej, z użyciem antybiotyków w ilości: 100 ?g/ml-1 streptomycyny i 100 ?g/ml-1 penicyliny. W celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 5x105 do sześciodołkowych plastikowych płytek (Corning). Hodowle przeprowadzano w czasie 48 godzin w temperaturze 37oC w atmosferze o zwiększonej wilgotności, zawierającej 10% CO2. Tak wyrośnięte komórki przemywano dwukrotnie PBS i dodawano do nich 500 ml testowych szczepów bakteryjnych oraz 500 ml świeżego medium hodowlanego DMEM bez dodatku antybiotyku. Komórki linii tkankowych wraz z badanymi szczepami inkubowano w temperaturze 37oC w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nieprzyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez pół godziny. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono metodą Grama. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000x. Adherencję określano półilościowo, licząc komórki E. coli przylegające do 20 komórek nabłonkowych. Wynik końcowy był średnią wartością z 20 pól.

B. Badanie właściwości antagonistycznych wybranych gatunków Lactobacillus wobec szczepów E. coli.

W celu wykazania wrażliwości wybranych szczepów E. coli na antagonistyczne działanie różnych gatunków bakterii z rodzaju Lactobacillus posłużono się metodą słupkową [16]. Zastosowano szczepy Lactobacillus wyizolowane wcześniej z pochwy zdrowych kobiet; przynależność gatunkową tych szczepów oznaczono genotypowo za pomocą techniki PCR [15]. Do badań wybrano losowo po dwa szczepy należące do następujących gatunków: L. acidophilus, L. delbrueckii, L. crispatus, L. johnsonii, L. plantarum, L. fermentum L. gasseri, L. rhamnosus. Słupki z hodowlami Lactobacillus nakładano na płytki zawierające podłoże Mueller Hintona (Biocorp) z naniesionymi uprzednio za pomocą wacika na powierzchnię agaru hodowlami szczepów wskaźnikowych (pięć szczepów E. coli pochodzących zarówno z pochwy, jak i dróg moczowych). Hodowle szczepów E. coli do tego testu prowadzono na podłożu TSA (bioMerieux) (24 godz., 37oC), następnie zawieszano w roztworze PBS uzyskując gęstość 109 kom. /ml. Płytki umieszczano na cztery godziny w lodówce w temp. 4oC, a po upływie tego czasu dalej je inkubowano w 37oC w warunkach tlenowych przez 18 godzin. Po inkubacji mierzono średnice stref zahamowania wzrostu szczepów wskaźnikowych podając wynik w mm. Różnice statystyczne między działaniem poszczególnych szczepów Lactobacillus na wskaźnikowe szczepy E. coli obliczono za pomocą testu t-Studenta dla poziomu istotności p<0,05.

Wyniki

Porównując właściwości powierzchniowe szczepów E. coli wyizolowanych z moczu i z pochwy za pomocą testu hemaglutynacji wykazano, że adhezyny typu P występowały jedynie wśród szczepów E. coli izolowanych z moczu (cztery przypadki na dziewięć), natomiast ich obecności nie wykazano u żadnego z dziewięciu szczepów E. coli pochodzących z mikroflory pochwy. Fimbrie typu 1 wykryto natomiast u wszystkich szczepów E. coli, niezależnie od miejsca ich pochodzenia (tab. II).

Badając chromosomalne DNA E. coli pod kątem obecności różnych genów kodujących struktury białkowe fimbrii P, S oraz Dr za pomocą metody multipleks PCR wykazano (ryc. 1), że geny afa 1 i 2 kodujące adhezynę Dr nie występowały w żadnym z badanych szczepów E. coli. Zaobserwowano również, że gen papC, kodujący białko, będące czynnikiem inicjującym proces formowania fimbrii P na błonie zewnętrznej, był obecny u 12 szczepów E. coli na 19 badanych, podczas gdy test hemaglutynacji potwierdził ten wynik jedynie w czterech przypadkach. Generalnie nie zaobserwowano żadnych prawidłowości związanych z miejscem pochodzenia badanych szczepów i obecnością genów kodujących poszczególne białka fimbrialne, co może świadczyć o dużym podobieństwie struktury genomów między tymi szczepami.

Analizując właściwości adherencyjne badanych szczepów E. coli względem komórek linii nabłonka pochwy A-431 i linii nabłonka pęcherza moczowego HCV-29 zaobserwowano ciekawą krzyżową zależność, bowiem więcej szczepów E. coli (7/9) izolowanych z dróg moczowych bardzo dobrze (+++) przylegało do komórek linii nabłonka pochwy, podczas gdy szczepy pochodzące z mikroflory pochwy częściej wykazywały lepsze powinowactwo do nabłonka pęcherza moczowego (6/9) (tab. III).

Badając właściwości antagonistyczne bakterii z rodzaju Lactobacillus wobec wybranych szczepów E. coli ? pochodzących zarówno z moczu, jak i z pochwy ? wykazano za pomocą metody słupkowej, iż największe średnice stref zahamowania wzrostu (powyżej 22 mm) wykazały gatunki L. plantarum i L. fermentum, natomiast szczepy zaliczane do tzw. grupy L. acidophilus (L. acidophilus sensu stricto, L. gasseri, L. johnsonii i L. gallinarum) charakteryzowały się nieco słabszą aktywnością antagonistyczną, zaś najmniejsze strefy zahamowania produkował gatunek L. delbrueckii (ryc. 2). Różnica między tymi ostatnimi a trzema pierwszymi gatunkami Lactobacillus była znamienna statystycznie (p<0,05). Wybrane szczepy E. coli reprezentujące różne fenotypy ekspresji adhezyn wykazywały podobną wrażliwość na działanie szczepów Lactobacillus występujących w normalnej florze pochwy.

Omówienie

Zakażenia dróg moczowych u kobiet wynikają z wielu przyczyn natury genetycznej i środowiskowej. Z tych ostatnich najważniejszą wydaje się być ukierunkowana, trwająca przez dłuższy okres (nawet do kilku tygodni) kolonizacja okolicy okołocewkowej szczepami E. coli pochodzącymi bezpośrednio z odbytu i/lub pośrednio z mikroflory pochwy [8,17].

Szczepy UPEC pochodzące z flory jelitowej muszą zatem cechować się pewnymi, uniwersalnymi właściwościami powierzchniowymi, umożliwiającymi im adherencję i kolonizację nabłonka pochwy i ujścia cewki. Rzeczywiście, wysokie powinowactwo szczepów E. coli izolowanych z moczu do nabłonka pochwy (wykazane w teście adherencji) może wskazywać pośrednio na ich wcześniejsze źródło pochodzenia z mikroflory pochwy. Z drugiej strony fakt, iż około 1/3 szczepów zachowywało bardzo dobrą adherencję zarówno do jednego, jak i do drugiego nabłonka może wskazywać na pojawianie się wśród populacji E. coli takich szczepów, które wykształciły na swojej powierzchni uniwersalne czynniki wirulencji umożliwiające im łatwe powinowactwo do różnych nabłonków gospodarza.

Ponadto zaobserwowano brak ekspresji fimbrii P u wszystkich szczepów E. coli pochodzących z dróg rodnych, które były jednak obecne na powierzchni około połowy szczepów E. coli pochodzących z moczu. Ponieważ u części szczepów nie mających fimbrii P można było jednak wykazać geny kodujące te adhezyny (pap C, E i F), dlatego postawiono hipotezę, że specyficzne warunki danej niszy ekologicznej mogą determinować ekspresję tych genów [18].

Zgodnie z wynikami otrzymanymi przez Schlager i współpracowników badane szczepy UPEC miały również fimbrie typu 1, które są uniwersalnie obecne na powierzchni wszystkich E. coli pochodzących z kału [18]. Ponadto, wykazywały, tak jak w cytowanych powyżej badaniach, dużą zmienność ekspresji powierzchniowych czynników wirulencji.

W otrzymanych wynikach wykazano również brak fimbrii Dr wśród badanych szczepów, co może wynikać z faktu, iż fimbrie Dr są jednym z rzadziej spotykanych czynników wirulencji, typowych raczej dla szczepów E. coli powodujących ciężkie zakażenia w formie odmiedniczkowego zapalenia nerek, występujące szczególnie u kobiet w ciąży [3].

Szczepy UPEC wykazują wrażliwość na antagonistyczne działanie niektórych bakterii z rodzaju Lactobacillus pochodzących z flory pochwy, które mogą zostać wykorzystane w przyszłości jako szczepy bakterii probiotycznych. Probiotykami, według nowoczesnej, szerokiej definicji nazywamy żywe drobnoustroje pochodzące z flory zdrowego człowieka, najczęściej z rodzaju Lactobacillus lub Bifidobacterium, które są dostarczane do ustroju gospodarza w celu poprawy jego stanu zdrowia przez zapobieganie lub leczenie ściśle zdefiniowanej jednostki chorobowej [19]. Dotychczasowe zastosowanie probiotyków najczęściej dotyczyło ostrych biegunek u dzieci, ale w ostatnich latach kilka grup badawczych pracuje intensywnie nad probiotykami, mającymi zapobiegać i leczyć stany zapalne pochwy, a także zakażenia dróg moczowych [12]. Dzięki tym pracom ukazał się doustny preparat zawierający dwa szczepy L. rhamnosus GR-1 i L. fermentum RC-14, mający wywierać zapobiegawcze działanie wobec właśnie tych ostatnich zakażeń [20].

Uzyskane w niniejszej pracy wyniki dają dobre podstawy mikrobiologiczne do selekcji szczepów z rodzaju Lactobacillus, właściwych do takiego zastosowania i wskazują podobnie na te same gatunki Lactobacillus (dodatkowo jeszcze L. plantarum), jako najbardziej aktywne in vitro wobec UPEC. Przyszłe zastosowanie szczepów probiotycznych o wybitnych właściwościach antagonistycznych wobec UPEC do celów profilaktycznych ma głębokie uzasadnienie, gdyż jedną z przyczyn zwiększonej kolonizacji ujścia cewki moczowej u kobiet szczepami E. coli jest eliminacja populacji Lactobacillus w pochwie spowodowana leczeniem zakażeń, także dróg moczowych, za pomocą antybiotyków, których zakres działania obejmuje również bakterie z rodzaju Lactobacillus [7,21].

Wnioski

Szczepy E. coli, powodujące u kobiet zakażenia dróg moczowych lub tlenowe, bakteryjne zapalenie pochwy, pochodzą z przewodu pokarmowego i są selekcjonowane w kierunku uniwersalnej zdolności do kolonizacji nabłonka pochwy i dróg moczowych. Istnieje zatem możliwość kontroli populacji uropatogennych szczepów E. coli, poprzez profilaktyczne, doustne lub dopochwowe podawanie właściwie wyselekcjonowanych szczepów probiotycznych Lactobacillus pochodzących z normalnej flory zdrowego człowieka.

1. Mabeck CE: Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgrad Med J 1972, 48, 69-75.
2. Gonzalez-Pedraza A, Ortiz C, Mota R et al: Role of bacteria associated with sexually transmitted infections in the etiology of lower urinary tract infection in primary care. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003, 21, 89-92.
3. Muhldorfer I, Ziebuhr W, Hacker J: Escherichia coli in urinary tract infections; in Sussman M (ed): Molecular Medical Microbiology, London, Academic Press, 2002, vol 2, pp 1515-1540.
4. Le Bouguenec Ch, Archambaud M, Labigne A: Rapid and specific detection of the pap, afa and sfa adhesin encoding operons in uropathogenic Escherichia coli strains by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992, 30, 1189-1193.
5. Przondo-Mordarska A, Matusiewicz K, Smutnicka D: Properties of Klebsiella P-like adhesin. Adv Clin Exp Med 2004, 13, 129-137.
6. Nowicki B, Selvarangan R, Nowicki S: Family of Escherichia coli Dr adhesins: decay-accelerating factor receptor recognition and invasiveness. J Infect Dis 2001, 183, 24-27.
7. Gupta K, Stapleton AE, Hooton TM et al: Inverse association of H2O2-producing and vaginal Escherichia coli colonization in women with recurrent urinary tract infections. J Infect Dis 1998, 178, 446-450.
8. Stamey TA, Sexton CC: The role of vaginal colonization with enterobacteriaceae in recurrent urinary infections. J Urol 1975, 113, 214-217.
9. Cook SW, Hammill HA, Hull RA: Virulence factors of Escherichia coli isolated from female reproductive tract infections and neonatal sepsis. Infect Dis Obstet Gynecol 2001, 9, 203-207.
10. Donder GG, Vereecken A, Bosmans E et al: Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. Brit J Obstet Gynecol 2002, 109, 34-43.
11. Mack DR, Michail S, Wei S et al: Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am J Physiol 1999, 276, G941-G950.
12. Reid G, Bruce AW: Selection of Lactobacillus strains for urogenital probiotic applications. J Infect Dis 2001, 183, S77-S80.
13. Kane TD, Alexander JW, Johannigman JA: The detection of microbial DNA in blood: a sensitive method for diagnosing bacteremia and/or bacterial translocation in surgical patients. Ann Surg 1998, 227, 1-9
14. Evans DG, Evans DJ Jr, Tjoa W: Hemagglutination of human group A erythrocytes by enterotoxigenic Escherichia coli isolated from adults with diarrhea: correlation with colonization factor. Infect Immun 1977, 18, 230-237.
15. Yamamoto S, Akito T, Kazuyo Y et al: Detection of urovirulence factors in Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction. FEMS Immunol Med Microbiol 1995, 12, 85-90.
16. Strus M, Malinowska M, Heczko PB: In vitro antagonistic effect of Lactobacillus on organisms associated with bacterial vaginosis. J Reprod Med 2002, 47, 41-46.
17. Scholes D, Hooton TM, Roberts PL i in: Risk factors for recurrent urinary tract infectionin young women. J Infect Dis 2000, 182, 1177-1182.
18. Schlager TA, Whittam TS, Hendley JO et al: Variation in frequency of the virulence-factor gene in Escherichia coli clones colonizing the stools and urinary tracts of healthy prepubertal girls. J Infect Dis 2003, 188, 1059-1064.
19. Reid G: The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus. Appl Environ Microbiol 1999, 65, 3763-3766.
20. Reid G, Burton J, Devillard E: The rationale for probiotics in female urogenital healthcare. Med Gen Med 2004, 6, 49.
21. Hooton TM, Hillier S, Johnson C: Escherichia coli bacteriuria and contraceptive method. JAMA 1991, 265, 64-69.

Magdalena Strus
ul. Wyżynna 20C
30-617 Kraków
tel. 0 601 290 767
fax (0 12) 423 39 24
mbstrus@cyf-kr.edu.pl