english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Na podstawie klasycznych badań histologicznych zauważono, że dla większości

komórek nowotworowych charakterystyczną cechą jest powiększenie jądra komórkowego i jego intensywniejsze wybarwianie za pomocą barwników zasado- wych, np. hematoksyliną, co związane jest z podwyższoną zawartościąjądrowego DNA. Zjawisko to potwierdzono w badaniach cytogenetycznych stwierdzając, że kariotyp komórek nowotworowych często wykazuje obecność aberracji chromosomowych, włącznie ze zwiększeniem liczby chromosomów. Ponadto obserwowano już od dawna, że komórki tkanek prawidłowych dzielą się jedynie w celu zastąpienia tych, które uległy zniszczeniu, natomiast w przypadku nowotworów zawodząmechanizmy kontroli tego procesu i liczba komórek proliferujących jest znacznie większa niż w zdrowej tkance. Określenie frakcji komórek proliferujących odzwierciedlałoby więc aktywność wzrostu nowotworu. Fakty popierające powyższe koncepcje były dokumentowane przez wiele lat, początkowo za pomocą statycznej cytofotometrii, a ostatnio cytofluorymetrii przepływowej -flow cytometry [7]. Przewaga tej ostatniej nad wcześniejszymi ocenami DNA, bazującymi na metodach mikroskopowych polega na fakcie, iż umożliwia ona obiektywną i szybką analizę dużej liczby komórek oraz ocenę statystyczną uzyskanych wyników [24].

Nieprawidłowa liczba chromosomów, często obserwowana w komórkach nowotworów, jest określana mianem aneuploidii. Jeżeli natomiast określamy nieprawidłową zawartość DNA w komórkach, posługujemy się terminem aneuploi- dia DNA. Analizując profil histogramu DNA, można też rozróżnić komórki będące w różnych fazach cyklu komórkowego, np.w fazie proliferacji. Zasada działania cytofluorymetru przepływowego jest w swych założeniach prosta. W przypadku badania zawartości DNA komórkowego utrwalone komórki lub izolowane jądra komórkowe przepływająprzez promień lasera powodujący fluorescencję barwnika- fluorochromu, proporcjonalną do zawartości DNA komórkowego. Rozkład intensywności fluorescencji przedstawiany jest w postaci histogramu (ryc. la – diploidalny, prawidłowy histogram, lb – aneuploidalny histogram). Przez ostatnie dwie dekady aneuploidia DNA była wykrywana w ponad 70% analizowanych guzów nowotworowych. Okazała się ona doskonałym markerem obecności populacji komórek złośliwych w wielu nowotworach, jak np. rak sutka, rak jajnika, rak jelita grubego, rak stercza, czerniak [11,25], Pierwsze doniesienia z cytofluorymetrycznego badania popłuczyn z pęcherza moczowego szybko ustabili- zowały pozycję tej techniki badawczej. Niezależnie od siebie Tribukait i Esposti z Karolinska Instytut w Sztokholmie oraz Melamed i Darżynkiewicz z Memorial Sloan Kettering Cancer Center w 1976 roku wykazali, że prawidłowe, nienowotworowe komórki nabłonka przejściowego mają diploidalną zawartość DNA, a w wypadku raka pęcherza moczowego występuje aneuploidalną populacja komórek [19,24,25]. Cytofluorymetryczne badanie popłuczyn pęcherza moczowego cechuje się dość dużą czułością diagnostyczną. Jeżeli czułość badania cytologicznego sięga od 45-70% i zależy od typu preparatu, wielkości i stopnia anaplazji guza, tak wg Kossa i Melame- da, to w zależności od przyjętych kryteriów oceny histogramów czułość cytofluory- metrii jest zawarta w przedziale od 78 do 93% przy specyficzności rzędu od 72 do 93% [1,2,18,21].

Zaskakująco późno określono prognostyczne znaczenie aneuploidii, bowiem do- piero opisana przez Hedleya w 1983 roku metoda ekstrakcji jąder ze skrawków zatopionych w parafinie pozwoliła na wykonanie badań retrospektywnych i określe- nie związku aneuploidii z przebiegiem choroby nowotworowej i przeżyciem określo- nej populacji chorych [13].

W celu określenia związku między pojawieniem się aneuploidii DNA a czasem przeżycia chorych przeprowadziliśmy w naszej klinice badania retrospektywne na archiwalnym materiale z bloczków parafinowych, uzyskanym po elektroresekcji przezcewkowej guzów pęcherza moczowego. Materiał ten zebrany w latach 1987- 1988 pochodził od chorych leczonych w Katedrze i Klinice Urologii AM we Wrocławiu. Badania wykonywano we współpracy z Oddziałem Radiobiologii Instytutu Karolińska w Sztokholmie, korzystając z pomocy konsultacyjnej prof. Bernharda Tribukaita.

MATERIAŁ I METODY

Badaniem objęto grupę 53 chorych z guzem pęcherza moczowego, którzy w latach 1987-1988 zostali poddani leczeniu w Klinice Urologii AM we Wrocławiu. W grupie tej było 41 mężczyzn, 12 kobiet, średni wiek chorych wynosił 64,2 lata (36- 84). Badano tkanki pochodzące z archiwalnych bloczków parafinowych, w których zatopione zostały fragmenty guzów pęcherza moczowego po elektroresekcji przezcewkowej wykonanej w 1987 i 1988 roku. Analizy cytofluorymetrycznej DNA z deparafinizowanych tkanek dokonano w Zakładzie Radiobiologii w Instytucie Karolińska. Stopień zaawansowania nowotworu określano na podstawie badania klinicznego, cystoskopii, badania dwuręcznego w znieczuleniu przed i po zabiegu, ultrasonografii przezpowłokowej i czasami śródpęcherzowej, urografii. W pobranych do badania wycinkach oraz w usuniętych tkankach guza określano stopień zaawan- sowania i stopień anaplazji nowotworu. Ponownej oceny histopatologicznej wszystkich preparatów dokonano w 1993 roku przez dr Ning Wang, lekarza patomorfologa i urologa z Zakładu Radiobiologii w Instytut Karolinska, posługując się podziałem trój- stopniowym anaplazji i klasyfikacjąTNM zalecanymi przez UICC i WHO. U wszy- stkich chorych stwierdzono nowotwory z nabłonka przejściowego. Niski stopień ana- plazji Gl stwierdzono w preparatach od 13 chorych (24%), wysoki G3 od 19 chorych (36%). Guzów powierzchownych (pTa i pT 1) w materiale było 21, a pT2, pT3 i pT4 odpowiednio 12,14 i 6. Wszystkich chorych w grupie badań retrospektywnych leczono pierwotnie stosując elektroresekcję przezcewkową guza. Po elektroresekcji u wszystkich chorych stosowano dopęcherzowo adriblastynę (50 mg), bezpośrednio po zabiegu, następnie przez okres miesiąca jednorazowo w tygodniu. Dawkę tę stosowano w terapii podtrzymującej przez okres roku jeden raz w miesiącu. Do dalszego leczenia skierowano 18 chorych. Cystektomii poddano 5 pacjentów, radioterapii 13 pacjentów (60 Gy u 8 chorych, 20 i 30 Gy u pozostałych, poddanych tylko paliatywnej radioterapii).

Posługując się metodą opisaną przez Hedleyea [13] w modyfikacji Heidena i Tribukaita [ 14] otrzymano zawiesinę pojedynczych jąder komórkowych z tkanek zatopionych w parafinie. Wcześniej, tuż po histologicznej ocenie preparatów, usunię- to z preparatów tkanki nie będące ściśle komórkami guza. Analizę przeprowadzano na cytofluorymetrze przepływowym PAS II (Partec, Munster, BRD), wyposażo- nym w lampę rtęciową (350-400 nm). Analizowano minimum 40 000 jąder, z prędkością około 500 jąder/sek. Do analizy histogramów używano programu analizującego DNA (Phoenix Flow System, San Diego, CA). Prawidłowe diploidalne komórki obecne w każdej próbce służyły za kontrolny standard wewnętrzny. Uzyskane histogramy klasyfikowane były jako diploidalne lub aneuploidalne.

ANALIZA STATYSTYCZNA

W prezentowanych badaniach w celu stwierdzenia istotnej statystycznej różnicy pomiędzy parametrami, wykonano test niezależności Chi-kwadrat, zaś siłę związku pomiędzy parami cech określono, porównując ze sobą współczynniki miary zależno- ści pomiędzy cechami: wpółczynnik kontyngencji, V-Cramera, Lambda, Gamma. Obliczeń statystycznych dokonano za pomocą programu komputerowego Stati- stica.

WYNIKI

W badaniach otrzymano 53 histogramy z tkanek guzów z bloczków parafino- wych: 22 diploidalnych i 31 aneuploidalnych. Ocena współczynnika proliferacji możliwa była tylko w 30 preparatach. Ploidia DNA a stopień zróżnicowania histopatologicznego. Wszystkie guzy GO i G1 były guzami diploidalnymi (14/14). W guzach G2 w 13 przypadkach pojawiła się aneuploidia, co stanowi 65% tej grupy guzów, w grupie tej znaleziono 4 przypadki guzów tetraploidalnych. W guzach G3 aż 95% guzów było aneuploidalnych (18/19), w tym 5 z kilkoma klonami aneuploidalnymi. Ploidia a stopień zaawansowania nowotworu. Guzy powierzchowne w więk- szości przypadków (19/20) były guzami diploidalnymi, natomiast guzy naciekające w 90% były guzami o nieprawidłowej, aneuploidalnej zawartości DNA. Czas przeżycia chorych a ploidia. W czasie 60 miesięcy obserwacji z grupy 53 chorych zmarło 28 osób, 17 po leczeniu tylko elektroresekcją, 9 po leczeniu skoja- rzonym. Z powodu uogólnionej choroby nowotworowej zmarło 26 (49%) chorych. Przyczyną zgonu pozostałych dwóch chorych nie był rak pęcherza. W grupie 22 chorych z guzami diploidalnymi zmarły z powodu uogólnionej choroby nowotworo- wej trzy osoby (18%).

W grupie 31 chorych z guzami aneuploidalnymi z powodu choroby nowotworowej zmarły w czasie obserwacji 23 osoby (65%), a średni czas przeżycia wynosił 22,7 miesięcy. Z 7 chorych, którzy przeżyli w tej grupie, u 6 zastosowano uzupełniające leczenie radykalne: u 4 osób radioterapię, a u dwóch cystektomię radykalną. Czę- stość występowania zgonów w różnych grupach chorych w zależności ploidii DNA i zastosowanego leczenia przedstawia tabela I.

Obliczone ponownie testem ?2 prawdopodobieństwo p wskazuje, że test odrzuca hipotezę o niezależności cech (aneuploidia i zgon) na bardzo małym poziomie istot- ności a rzędu 0,00005 (p

-guzy naciekające (T2-T4) i zgon (0,60111,0,75217,0,67442),

-aneuploidia i zgon (0,57497,0,74216,0,60000),

-wysoki (G2 i G3) stopień anaplazji i zgon (0,53241,0,62897,0,26667).

Naciekający charakter guza i pojawienie się aneuploidii prognozowały więc nie- korzystny przebieg choroby u pacjenta trafniej niż stopień anaplazji guza. Współczynnik proliferacji (LP.). Współczynnik proliferacji, czyli procent ko- mórek w fazie S+G2/M, był możliwy do określenia tylko w histogramach u 30 cho- rych. W pozostałych histogramach wysoka wartość CV. (powyżej 3%) lub obe- cność silnego odczynu zapalnego uniemożliwiała właściwą ocenę ocenę frakcji pro- 1 i ferującej. Ze względu na zbyt małą ilość przypadków, w których możliwy był do określenia współczynnik proliferacji, otrzymanych wyników nie poddano analizie sta- tystycznej.

DYSKUSJA

W prezentowanych badaniach podjęto próbę oceny aneuploidii DNA jako czynni- ka niekorzystnej prognozy u pacjentów z rakami przejściowokomórkowymi pęche- rza moczowego. Aneuploidia pojawiła się w ponad połowie przypadków (58%) w materiale archiwalnym, tkanek zatopionych w parafinie z guzów pęcherza moczo- wego od 53 chorych. W doniesieniach różnych autorów stwierdzony odsetek guzów aneuploidalnych wynosi od 37 do 66% przypadków (tabela 2).

Różnice w uzyskanych wynikach są prawdopodobnie spowodowane wieloma czynnikami, jak np. różnicami w doborze pacjentów i metod laboratoryjnych, bra- kiem standaryzacji technik laboratoryjnych, a także różnicami w interpretacji uzy- skanych w cytofluorymetrze wyników. Wielu autorów, w tym Tribukait i Esposti z Karolinska Instytut [26] oraz Melamed i Klein z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center [ 17] uzyskało podobny odsetek guzów aneuploidalnych w badanym materia- le, a większość opisuje wzrastającą tendencję pojawiania się aneuploidii w miarę wzrostu stopnia anaplazji guza. Podobną wzrastającą tendencję wykazały nasze badania DNA tkanek z bloczków parafinowych w materiale archiwalnym.

W guzach G2 i G3 aneuploidię wykrywano w badaniach retrospektywnych w podobnym odsetku przypadków, jak w przeprowadzanych przez nas badaniach pro- spekty wnych na materiale świeżym. Natomiast w guzach GO i Gl w badaniach retrospektywnych nie zaobserwowano pojawiania się aneuploidii, podczas gdy w badaniach prospektywnych w guzach GO i Gl jest ona obecna w 7% i 30% guzów.

Zgodne jest to ze spostrzeżeniami innych autorów, iż podczas wielostopniowej pro- cedury odzyskiwania materiału genetycznego z tkanek z bloczków parafinowych, małe populacje komórek aneuploidalnych mogą ulec zniszczeniu, szczególnie w gu- zach, w których zmiany ilościowe w DNA są dyskretne [15,16]. Także duża ilość artefaktów i szeroki diploidalny szczyt (wysokie C.V.) spowodowany nierównomier- nym wysyceniem barwnikiem fluorescencyjnym jąder w histogramach z deparafi- nowanych tkanek może ukryć istnienie niewielkiej populacji aneuploidalnej. Ważny jest też fakt, że w badaniach prospektywnych używano materiał zarówno z popłu- czyn, jak i tkanek, co przyczyniło się do lepszej wykrywalności populacji aneuploidal- nych.

Znaleziona zależność między stopniem zróżnicowania histopatologicznego aploi- diąpozwala nam podzielić guzy pęcherza moczowego na dwie grupy: guzy diploidal- ne i aneuploidalne, a stwierdzona znacząca korelacja między aneuploidiąa inwazyj- nościąguza pozostaje w zgodzie z obserwacjami innych autorów [3,12,27].

Przeprowadzone badania wykazały wysoką wartość rokowniczą oceny ploidii.

Analiza zgonów dokonana w grupie retrospektywnej, potwierdza, że aneuploidia znamiennie prognozuje niekorzystne rokowanie u chorych z rakiem pęcherza mo- czowego. Oczywiście na czas przeżycia w obu grupach mógł mieć wpływ rodzaj następującej po elektroresekcji terapii stosowanej u chorego. Stosowano bowiem u chorych radioterapię w dawkach paliatywnych lub radykalnych oraz cystektomię.

Pomimo to odsetek zgonów w grupie aneuploidalnej, w której przeważały te formy terapii, był zdecydowanie wyższy. W grupie pacjentów z guzami diploidalnymi odse- tek zgonów wynosił 9%, zaś w grupie z guzami aneuploidalnymi 65%. Malmstrom, Tribukait, Murphy, Bloumjous, Campanella i Pavone-Macaluso podająodsetek zgo- nów 10-35% wśród chorych z guzami diploidalnymi i 33-67% wśród chorych z guzami aneuploidalnymi w okresie pięcioletnim [3,19,21,22,27]. Rozbieżności w ocenie spowodowane są rodzajem zastosowanej terapii, jak i doborem przypadków.

Niemniej jednak zgodnie podkreślany jest fakt, iż pojawienie się populacji komórek aneuploidalnych, a tym bardziej kilku różnych klonów komórek aneuploidalnych, pro- gnozuj e niekorzystnie dla chorych z rakiem pęcherza moczowego. Przeprowadzone w mojej pracy analizy statystyczne, w których porównano ze sobą współczynniki miary zależności pomiędzy cechami (współczynnik kontyngencji, V Cramera, Lambda) pozwoliły stwierdzić, iż najsilniej prognozujązgon stopień zaawansowania kliniczne- go oraz pojawienie się aneuploidii, w mniejszym stopniu stopień anaplazji i wieloogni- skowość guzów. Zgodne jest to z doniesieniem tych autorów [ 19,23], którzy podda- jąc analizie modelem Coxa wszystkie parametry prognostyczne guzów pęcherza moczowego wykazali, że głównie stopień naciekania i aneuploidia znamiennie ma związek z czasem przeżycia w całej grupie chorych, a szczególnie wśród chorych z guzami powierzchownymi ten związek jest widoczny.

W ocenie fazy proliferującej nie udało się uzyskać zadowalających wyników, bo- wiem w ponad połowie przypadków dokładna ocena współczynnika proliferacji nie była możliwa. Wiele czynników zaburza ocenę fazy S i G2/M w cytofluorymetrii przepływowej. Powszechnie podważana jest możliwość uzyskania dokładnej warto- ści współczynnika proliferacji w skrawkach archiwalnych [7, 12,28], w których wielostopniowa procedura laboratoryjna powoduje utratę części populacji komórek nowotworowych, zaś duża ilość zdenaturowanego DNA, fragmentów pociętych ją- der oraz uwolnionych przez enzymatyczne trawienie towarzyszących guzowi ko- mórek zrębu i komórek odczynu zapalnego nie pozwala często na wyodrębnienie komórek w fazie proliferacji. Także zły sposób utrwalania (niezbuforowana formali- na) i przechowywania bloczków parafinowych mająbyć wg Hedleyea i Shankeyea [ 14,24] odpowiedzialne za złąj akość histogramów (tj. szeroki szczyt G1, czyli wysoka wartość CV.), w których ocena dystrybucji komórek w fazie S jest mało możliwa.

WNIOSKI

Pojawienie się aneuploidii prognozuje znamiennie niekorzystne rokowanie co do przeżycia. Z analizy statystycznej wynika, że wartość rokowniczą ploidii w progno- zowaniu zgonu ma większe znaczenie niż dotychczas stosowane wskaźniki pro- gnostyczne, jak: stopień zróżnicowania histopatologicznego (G), charakter wzrostu guza i liczba guzów, a nieznacznie tylko ustępuje określeniu stadium zaawansowania (TNM). Aneuploidia DNA może być wczesnym czynnikiem rokowniczym pozwa- lającym na wyselekcjonowanie chorych o niekorzystnej prognozie i wymagających wczesnego podjęcia radykalnego leczenia.

Ploidia DNA oznaczana cytofluorymetrycznie w materiale archiwalnym z tkanek w bloczkach parafinowych może być cennym uzupełnieniem w diagnostyce i pro- gnozowaniu powierzchownych guzów pęcherza moczowego. Warto jednak podkre- ślić, iż odzyskiwanie materiału biologicznego ze skrawków parafinowych jest praco- chłonne i wymaga wielostopniowej procedury laboratoryjnej, a więc w porównaniu z określaniem ploidii w materiale świeżym (popłuczyny i bioptaty) ma mniejszą war- tość w rutynowej diagnostyce klinicznej.

1. [1] Amberson, J. B., Laino, J. E: Image cytometric deoxyribonucleic acid analysis of
2. urine specimens as an adjunct to visual cytology in the detection of bladder carci-
3. noma. J.Urol. (1993), 149, 42.
4. [2] Badalament, R., Kimmel, H., Gay, H., i wsp. :The sensitivity of flow cytometry com-
5. pared with conventional cytology in the detection of superficial bladder carcino-
6. ma. Cancer, (1987), 59, 2078.
7. [3] Blomjous, E. C, Shipper, N. W., Baak, J. P, i wsp.: The value of addition to classic
8. prognosticators in superficial urinary bladder carcinoma. Am. J. Clin. Pathol.,
9. (1989), 91,43.
10. [4] Boccon-Gibbod, L., Leku, C, Herve, J. M., i wsp.: Bladder tumours iiwading the
11. lamina propria (Stage A/Tl) influence of endovesical Bacillus Calmette-Guerin
12. on recurrence and progresion. Eur. Urol., (1989), 16,401.
13. [5] Chin, J. L, Hubben, R. E, Nava, E.: i wsp.: Flow cytometry analysis of DNA con-
14. tent in human bladder tumours and irrigation fluids. Cancer, (1985), 56,167- 166.
15. [6] Coon, J. S., Schwartz, D., Summers, J. L., i wsp.: Flow cytometric analysis of depa-
16. raffinized nucleus in urinary carcinoma. Comparison with cytogenetic analysis.
17. Cancer, 19886,57,1594.
18. [7] Crisman, J. D., Zarbo, R. J., Niebylskl, Ch. D., i wsp.: Flow cytometric DNA analysis
19. of colo adenocarcinomas: a comparative study of preparatory techniąues. Modern
20. Pathology, (1988), 1,198.
21. [8] De Vere White, R. W., Deith, A., West, B., i wsp.: The predictive value of flow
22. cytometric information in the clinical management of stage O (Ta) bladder cancer.
23. J. Urol. (1988), 139, 279.
24. [9] De Vita, R., Forte, D., Cavallo, D, i wsp.: Survival and tumor progression in human
25. bladder carcinomas related to cytometric parameters. Basic. Appl. Histochem.,
26. (1990), 34, 316.
27. [10] Devonec, M.: Une nouvelle hypothese sur 1'histoire naturelle du cancer de la vessie
28. grace a 1'etude du contenu en ADN des tumeurs par la cytometrie en flux. Ann.
29. Urol., (1987), 21, 250.
30. [11] Friedlander, M. L., Hedley, D. W, Swanson, C, i wsp.: Prediction of long-term sur-
31. vival by flow cytometric analysis of cellular DNA content in patients with advan-
32. ced ovarian cancer. J. Clin. Oncol.,(1988), 6 (2), 282.
33. [12] Hedley, D. W, Fiendlander, M. L., Taylor, J. W: Application of DNA flow cytometry
34. to paraffin-embedded archival material for the study of aneuploidy and its clinical
35. significance. Cytometry, (1985), 6,32749.
36. [13] Hedley, D. W., Friedlender, M. L., Taylor, I. W i wsp.: Methods for analysis of cellular
37. DNA content of paraffin embedded pathologic material using flow cytometry. J.
38. Histochem. Cytochem., (1983), 31,1333.
39. [14] Heiden, T, Nainning, W, Tribukait, B.: An improved Hedley method for prepara-
40. tion of paraffin-embedded tissues for flow cytometric analysis of ploidy and S-
41. phase. Cytometry, (1992), 12,614.
42. [15] Jacobsen, A. B., Berner, A., Juul, M., i wsp.: DNA flow cytometry and neoadjuvant
43. chemotherapy / radiotherapy in operable muscle-invasive bladder carcinoma. Eur.
44. Urol., (1992), 22, 316.
45. [16] Jacobsen, A. B., Pettersen, E. O., Amellem, O., i wsp.: The Prognostic significance of
46. DNA flow cytometry in muscle invasive bladder carcinoma treated with preopera-
47. tive irradiation and cystectomy. J. Urol., (1992), 147,34.
48. [17] Klein, F.A., Herr, H. W., Melamed, M.: Flow cytometry follow-up of patients with
49. low stage bladder tumors. J.Urol., (1982), 126,88.
50. [18] Koss, L., Wersto, R., Simmons, D., i wsp.: Predictwe value of DNA measurement in
51. bladder washings: Comparison of flow cytometry, image cytometry and cytology in
52. patients with past history of urothelial tumors. Cancer, (1989), 64,916.
53. [19] Malmstrom, FU.: Prognosis of transitional cell bladder carcinoma with special
54. reference to ABH blood group isoantigen expression and DNA analysis. Scand. J.
55. Urol. Nephrol. Suppl., (1988), 112,1.
56. [20] Melamed, M. R., Traganos, E, Darżynkiewicz, Z,: Urinary cytology automation.
57. Preliminary studies with acridine orange stain and flow through cytofluorometry.
58. Iiwest. Urol., (1976), 13,331.
59. [21] Murphy, W, Emerson, L., Chandler, R. i wsp.: Flow cytometry versus urinary
60. cytology in the evaluation of patients with bladder cancer. J.Urol., (1986), 815.
61. [22] Murphy, W M., Chandler, R. W, Trafford, R. W: Flow cytometry of deparaffinized
62. nuclei compared to histological grading for the patological evaluation of transitio-
63. nal cell carcinomas. J. Urol, (1986), 135, 694.
64. [23] Nagel, R, Al-Abadi, H.: DNA content and survival rates of patients with transitio-
65. nal cell carcinoma of the bladder. J. Urol, (1994), 151,37.
66. [24] Shankey, T. V, Rabinovitch, F S., Bagwell, B., i wsp.: Guidelines for Implementation
67. of clinical DNA cytometry. Cytometry, (1993), 14,472.
68. [25] Stuart-Harris, R., Hedley, D. W, Taylor, I. W: Tumor ploidy, response and survival in
69. patients received endocrine therapy for advanced breast cancer. Br. J. Cancer,
70. (1985), 51, 525.
71. [26] Tribukait, B., Esposti, R: Quantitive flow-microfluorymetric analisis of the DNA
72. in cells from neoplasm of the urinary bladder: Correlation of aneuploidy with
73. histological grading and the cytological findings. Urol.Res, (1978), 6,201.
74. [27] Tribukait, B.: Flow cytometry in assessing the clinical agressivenes of genitourinary
75. neoplasm. Word J. Urol. (1987), 5,108.
76. [28] Wheeles, L. L., Badalament, R. A., De Vere White, R. W, Fradet, Y, Tribukait, B.:
77. Consensus review of the clinical utylity of DNA cytometry in bladder cancer.
78. Cytometry (1993), 14,478.
79. [29] Winkler, H. Z, Nativ, O., Hosaka, Y, i wsp.: Nuclear deoxyribonucleic ploidy in
80. sąuamouscell bladder cancer. J. Urol, (1989), 141,297.