PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Wartość prognostyczna cytometrii przepływowej w raku nerki
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2004/57/3.

autorzy

Janusz Dembowski 1, Michał Wróbel 1, Anna Kołodziej 1, Danuta Duś 2, Bartosz Małkiewicz 1, Jarosław Kasprzak 1, Krzysztof Dudek 3
1 Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej we Wrocławiu
2 Instytut Immunologii PAN we Wrocławiu
3 Politechnika Wrocławska, Instytut Konstrukcji i Eksploatacji Maszyn

słowa kluczowe

nerka, rak nerki, ploidia, frakcja fazy S, frakcja proliferacyjna

streszczenie

wstęp
Rak nerki wciąż jest problemem diagnostycznym i terapeutycznym z powodu występowania przerzutów odległych, także u pacjentów z chorobą pierwotnie w stopniu zaawansowania N0M0. Możliwość wcześniejszej adjuwantowej immunoterapii wymusza konieczność znalezienia dodatkowych czynników prognostycznych. Jednym z nich może być aneuploidia – zawartość DNA w nowotworowym jądrze komórkowym, inna niż w prawidłowym jądrze. Czynnikami wiązanymi z gorszym rokowaniem są także inne parametry uzyskiwane w cytometrii przepływowej – frakcja fazy S (S-Phase Fraction – SPF) i frakcja proliferacyjna (Proliferating Phase Fraction – PPF), świadczące o intensywności podziałów komórkowych. Celem niniejszej pracy jest ocena wartości prognostycznej ploidii DNA, frakcji fazy S i frakcji proliferacyjnej w porównaniu z klasycznymi czynnikami – zaawansowania guza T i złośliwości Nuclear Grade (G).
materiał i metoda
51 pacjentów leczonych operacyjnie z powodu raka nerki w stopniu zaawansowania N0M0. Pacjentów podzielono na dwie grupy: pacjenci bez przerzutów (grupa I) i pacjenci, u których przerzuty rozwinęły się w trakcie obserwacji (grupa II). Okres obserwacji wynosił od 18 do 36 miesięcy. Z preparatów pooperacyjnych pobierano prospektywnie po trzy próbki i przechowywano w temp. -22oC.
Próbki barwiono propidkiem jodu i badano w cytometrze przepływowym (FACSCalibur, Becton Dickinson). Ploidię oceniano w porównaniu ze standardową zawiesiną limfocytów. Do analizy statystycznej używano testu Fishera (porównanie częstości występowania aneuploidii) i testu UManna-Whitneya (do porównania frakcji fazy S i frakcji proliferacyjnej). Obliczenia wykonano w programie STATISTICA v. 6.0 (StatSoft).
wyniki
Aneuploidię stwierdzono w 23,5% guzów, 15% w grupie I i 54,5% w grupie II (Test Fishera, p<0,05). Frakcja fazy S wynosiła średnio 9,9%, a w grupach odpowiednio: 8,5% i 14,9% (Test UManna-Whitneya, p<0,01). Frakcja proliferacyjna w całej grupie badanej wynosiła 15,0%, w grupie I 12,7%, w grupie II 23,2% (Test UManna-Whitneya, p<0,001). Najwyższą czułość (81,8%) w wyłonieniu grupy pacjentów, u których w przyszłości rozwiną się przerzuty, wykazuje zaawansowanie guza T>2 i SPF>11%. Pozostałe czynniki (Nuclear Grade, aneuploidia, PPF i SPF) nie wykazują wyższej czułości samodzielnie lub w połączeniu. Najwyższą (94,9%) swoistość (przy niskiej czułości) wykazało połączenie T, Nuclear Grade i aneuploidii. SPF powyżej 11% wiązało się z najwyższą negatywną wartością prognostyczną (93,1%). Aneuploidia w połączeniu z zaawansowaniem guza T wykazywała najwyższą pozytywną wartość prognostyczną.
wnioski
Aneuploidia w połączeniu z T>2 wiąże się z 66,7% prawdopodobieństwem pojawienia się przerzutów u pacjentów pierwotnie N0M0. Ta grupa powinna być objęta bardzo ścisłym nadzorem i – być może – adjuwantową immunoterapią. Pacjenci z niską wartością SPF mogą podlegać mniej intensywnej kontroli.

Wstęp

Odległe efekty leczenia raka nerki nadal są niezadowalające, głównie z powodu występowania przerzutów u pacjentów leczonych radykalnie. Zmusza to do poszukiwania czynników prognostycznych, umożliwiających wyłonienie pacjentów wymagających bardziej agresywnego postępowania, np. adjuwantowej immunochemioterapii [1]. Jednym z intensywnie badanych czynników prognostycznych jest zawartość DNA (ploidia), a także inne parametry uzyskiwane w cytometrii przepływowej [2,3,4,5,6,7]. Prawidłową zawartość DNA nazywamy diploidalną a inną – aneuploidalną (hiperploidalną, gdy jest większa niż diploidalna i hipoploidalną, gdy jest mniejsza) (ryc. 1). Cytometria przepływowa umożliwia szybkie zbadanie ploidii DNA w kilkudziesięciu tysiącach komórek. Dzięki temu możliwe jest wykrycie odchyleń wynikających z utraty jednego lub dwóch chromosomów i niewielkiej (kilkuprocentowej) zawartości komórek aneuploidalnych. Metoda pozwala nie tylko na określenie ploidii DNA, ale także zawartości komórek w fazie S, czyli frakcji fazy S (S-Phase Fraction – SPF) i zawartości wszystkich komórek proliferujących (Proliferating Phase Fraction – PPF). Parametry te określają aktywność proliferacyjną guza i wiążą się z rokowaniem [8,9,10].

Materiał i metoda

51 pacjentów leczonych operacyjnie z powodu raka nerki w stopniu zaawansowania T1-T4, N0M0. Najczęściej stwierdzanym podtypem histologicznym był konwencjonalny rak jasnokomórkowy, rzadziej papilarny i onkocytarny. W jednym przypadku równocześnie wystąpił rak konwencjonalny i onkocytarny (ryc. 2).

Pacjentów podzielono na dwie grupy: pacjenci bez przerzutów (grupa I) i pacjenci, u których przerzuty rozwinęły się w trakcie obserwacji (grupa II). Okres obserwacji wynosił od 18 do 36 miesięcy.

Z preparatów pooperacyjnych pobierano prospektywnie po trzy próbki, które przechowywano w temp. -22şC. Próbki po rozmrożeniu rozdrabniano, usuwano kwas rybonukleinowy RNA, barwiono propidkiem jodu i badano w cytometrze przepływowym (FACSCalibur, Becton Dickinson). Ploidię oceniano w porównaniu do standardowej zawiesiny limfocytów. Do analizy statystycznej używano testu Fishera (porównanie częstości występowania aneuploidii) i testu UManna-Whitneya (do porównania frakcji fazy S i frakcji proliferacyjnej). Obliczenia wykonano w programie STATISTICA v. 6.0 (StatSoft).

Wyniki

Aneuploidię stwierdzono w 23,5% guzów, przy czym było to 15% w grupie I i 54,5% w grupie II. Różnica ta była istotna statystycznie na poziomie p<0,05 (test Fishera). Frakcja fazy S wynosiła średnio 9,9%, a w grupach odpowiednio: 8,5% i 14,9% (różnica istotna statystycznie, test UManna-Whitneya, p<0,01). Frakcja proliferacyjna w całej grupie badanej wynosiła 15%, w grupie I 12,7%, w grupie II 23,2% (różnica istotna statystycznie, test UManna-Whitneya, p<0,001).

Najwyższą czułość (81,8%) w wyłonieniu grupy pacjentów, u których w przyszłości rozwiną się przerzuty wykazuje zaawansowanie guza T>2 i frakcja fazy S>11% (tab. 1). Pozostałe czynniki (Nuclear Grade, aneuploidia, PPF) nie wykazują wyższej czułości samodzielnie lub w połączeniu. Najwyższą (94,9%) swoistość (przy niskiej czułości) wykazało połączenie T, Nuclear Grade i aneuploidii. SPF powyżej 11% wiązało się z najwyższą negatywną wartością prognostyczną (93,1%). Aneuploidia w połączeniu z zaawansowaniem guza T>2 wykazywała najwyższą (66,7%) pozytywną wartość prognostyczną.

Omówienie

Częstość występowania aneuploidii w badaniach dotyczących raka nerki wahała się od 33% do 87,5% [8,11]. Autorzy w swoim badaniu stwierdzili aneuploidię w 23,5% guzów, jednak była to grupa złożona wyłącznie z guzów ograniczonych do narządu lub zaawansowanych miejscowo. Znaczenie prognostyczne aneuploidii polega przede wszystkim na związku z częstszym powstawaniem przerzutów [12,13,14,15,16,17] i z czasem przeżycia [2,3,4,18,19,10,6,20,17]. O przydatności klinicznej ploidii w raku nerki może świadczyć także próba zastosowania wskaźnika aneuploidii w kwalifikacji pacjentów do wcześniejszej immunoterapii [21,1]. W wielu badaniach nie potwierdzano jednak korelacji ploidii z G i zaawansowaniem nowotworu [3,22,23] oraz znaczenia klinicznego (progresja, czas przeżycia) aneuploidii [24,25,8,5,26,22,23,27]. Wysoka aktywność proliferacyjna w badaniach doświadczalnych jest jednym z czynników karcynogenezy sprzyjających powstawaniu kolejnych, wtórnych zaburzeń genetycznych. Z tego powodu wyższa aktywność proliferacyjna wiąże się między innymi z aneuploidią [28]. Stwierdzano co prawda, że frakcja fazy S nie wnosi dodatkowych informacji na temat zaawansowania guza T i złośliwości Nuclear Grade G [29], jednak inni badacze zauważyli, że niska frakcja fazy S wiąże się z dłuższym przeżyciem [8,10]. Podobne spostrzeżenie wynika z naszego materiału, gdzie niska (<11%) frakcja fazy S wykazuje wysoką negatywną wartość prognostyczną, łącząc się z małym prawdopodobieństwem rozwoju przerzutów.

Wnioski

Aneuploidia w połączeniu z zaawansowaniem guza T3 lub T4 wiąże się z 66,7% prawdopodobieństwem pojawienia się przerzutów u pacjentów pierwotnie w stopniu zaawansowania N0M0. Ta grupa powinna być objęta bardzo ścisłym nadzorem i być może adjuwantową immunoterapią. Pacjenci z niską wartością SPF (<11%) mogą podlegać mniej intensywnej kontroli.

Piśmiennictwo

  1. Schafhauser W, Liedl T, Elsasser D, Zorcher T, Schrott K M: Flow cytometric analysis of DNA aneuploidy subgroups and proloferation in renal cell carcinoma. Anticancer Res 1999; 19: 1471-1475.
  2. Abou-Rebyeh H, Borgmann V, Nagel R, Al-Abadi H: DNA Ploidy Is a Valuable Predictor for Prognosis of Patients with Resected Renal Cell Carcinoma. Cancer 2001; 92: 2280-2285.
  3. Chin JL, Pontes JE, Frankfurt OS: Flow cytometric desoxyribonucleic amid analysis of primary and metastatic human renal cell carcinoma. J Urol 1985; 133: 582-585.
  4. DeKernion JB, Mukamel E, Ritchie AW, Blyth B, Hannah J, Bohman R: Prognostic significance of the DNA content of renal carcinoma. Cancer 1989; 64: 1669-1673.
  5. Ljungberg B, Larsson P, Stenling R, Roos G: Flow cytometric deoxyribonucleic amid analysis in stage I renal cell carcinoma. J Urol 1991; 146: 697-699.
  6. Ljungberg B, Landberg G, Alamdari FI: Factors of importance for prediction of survival in patients with metastatic renal cell carcinoma, treated with or without nephrectomy. Scand Urol Nephrol 2000: 34: 246-251.
  7. Schwabe H, Adolphis HD: Flow-cytophotometric studies in renal carcinoma. Urol Res 1983; 11: 121-125.
  8. Grignon DJ, Abdel-Malak M, Mertens W, Koster J, Keeney M, Sakr W: Prognostic significance of cellular proliferation in renal cell carcinoma: a comparison of synthesis-phase fraction & proliferating cell nucler antigen index. Mod Pathol 1995; 8: 18-24.
  9. Kołodziej A, Lorenz J: The predictive value of flow cytometry analysis in bladder cancer-study comparing paired specimens from bladder washing and tissue. Brit J Urol 1997; supp. 80 (2): 28.
  10. Larsson P: Cell proliferation in renal cell carcinoma. A clinical study with special reference to prognosis. Scand J Nephrol 1994; suppl 165: 1-48.
  11. Pepe S, Rugiero A, D’Acquisito M, De Laurentiis M, De Placido S, Sandomenico C, Staibano S, De Rosa G, Lucariello A, D’AmientoD, Bianco Blanco Blanco: Nuclear DNA content-derived parameters correlated with heterogeneous expression of p53 and bcl-2 proteins in clear cell renal carcinomas. Cancer 2000; 89: 1065-1075.
  12. Currin SM, Lee SE, Walther PJ: Flow cytometric assessment of deoxyribonucleic amid content in renal adenocarcinoma: does ploidy status enhance prognostic stratification oper stage alone? J Urol 1990; 143: 458-463.
  13. Ljungberg B, Stenling R, Ross G: DNA kontent and prognosis in renal cell carcinoma. A comparison between primary tumors and metastases' Cancer 1986; 57: 2346-2350.
  14. Oosterwijk E, Warnaar SO, Zwartendijk J, van der Velde EA, Fleu GJ, Corneliesse C J: Relationship between DNA ploidy, antygen expression and survival in renal cell carcinoma. Int J Cancer 1988; 42; 703-708.
  15. Otto U, Baisch H, Hulland H, Kloppel G: Tumor cell deoxyribonucleic amid content and prognosis in human renal cell carcinoma. J Urol 1984; 132: 237-239.
  16. Papadopoulos I, Weichert-Jacobsen K, Wacker H H, Sprenger E: Correlation beetwen DNA ploidy, the proliferation marker Ki-67 and early tumor progression in renal cell carcinoma A prospective study. Eur Urol 1997; 31: 49-53.
  17. Rainwater LM, Hosaka Y, Farrow G: Well differentiated clear cell carcinaoma: Significance of nuclear deoxyribonucleic amid patterns studiem by flow cytometry. Cytometr J Urol 1987; 137: 15-20.
  18. Feil G, Mittermuller B, Bichler KH, Wunder A, Wechsel HW, Nelde HJ, Krause F: DNA cytophotometry in renal cell carcinoma: a significant prognostic factor? Anticancer Res 1999; 19: 1483-1486.
  19. Grignon DJ, Ayala AG, el-Naggar El, Wishnow KI, Ro JY, Swanson, McLemone D, Giacco GG, Guinee GG: Renal cell carcinoma. A clinicopathologic and DNA flow cytometric analysis of 103 cases. Cancer 1989; 64: 2133-2140.
  20. Ljundberg B, Forsslund G, Stenling R, Zetteberg A: Prognostic significant DNA content in renal cell carcinoma. J Urol 1986; 135: 422-426.
  21. Ruiz Cerda J L, Hernandez M, Komis F, Vera C D, Kimler B F, O’Connor J E, Jimenez-Cruz F: Value of deoxyribonucleic acid ploidy and nuclear morphometry for prediction of disease progression in renal cell carcinoma. J Urol 1996; 155: 459-465.
  22. Papadopoulos I, Rudolph P, Weichert-Jacobsen K: Value of p53 expression, cellular proliferation and DNA content as prognostic indicators in renal cell carcinoma. Eur Urol 1997; 32: 110-117.
  23. Tannapfel A, Hahn HA, Katalinic A, Fietkau RJ, Kuhn R, Wittekind CW: Prognostic value of ploidy and proliferation markers in renal cell carcinoma. Cancer 1996; 77: 164-171.
  24. van-Bezooijen RL, Goey H, Stoter G, Hermans J, Fleuren GJ: Prognostic markers for survival in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with interleukin-2. Cancer-Immunol-Immunother. 1996; 43: 293-298.
  25. Flint A, Grossman HB, Liebert M, Lloyd RV, Bromberg J: DNA & PCNA content of renal cell carcinoma and prognosis. Am J Clin Pathol 1995; 103: 14-19.
  26. Nakano E, Kondoh M, Okatani K, Seguchi T, Sugao H: Flow cytometric analysis of nuclear DNA content of renal cell carcinoma correlated with histologic and clinic features. Cancer 1993; 72: 1319-1323.
  27. Yokogi H: Flow cytometric quantitation of the proliferation-associated nuclear antigen p105 & DNA content in patients with renal cell carcinoma. Cancer 1996; 78: 819-826.
  28. Dembowski J, Kołodziej A, Duś D, Dąbrowska B, Wróbel M: DNA Ploidy in Renal Cancer – Preliminary Report. Adv Clin Exp Med 2003; 12, suppl 1: 43-44.
  29. Gelb AB, Sudilovsky D, Wu CD, Weiss LM, Medeiros LJ: Appraisal of intratumoral microvessel density, MIB-1 score, DNA content amd p53 protein expression as prognostic indicators in patients with locally confined renal cell carcinoma. Cancer 1997; 80: 1768-1775.
Adres autora:
Janusz Dembowski
Klinika Urologii AM
pl. 1 Maja 8
50-043 Wrocław
tel. (0 71) 34 347 59