Pomimo znacznego postępu w leczeniu nowotworów, rak nerkowokomórko-
wy (RCC – renal cell cancer) nadal stanowi istotny problem terapeutyczny. RCC cechuje się znaczną skłonnością do tworzenia przerzutów [3]. Dane statystyczne oparte na dużym materiale wykazują że przerzuty istniejąu około 25% pacjentów w trakcie pierwszego kontaktu z lekarzem. Po leczeniu, którego podstawą, w chwili obecnej jest nefrektomia radykalna, przerzuty wystąpią u 30%-50% pacjentów uważanych za wyleczonych, wciągu 2 lat po zabiegu [2].
Jednocześnie zagadnienie komplikuje oporność komórek raka nerkowokomór-
kowego na stosowane obecnie cytostatyki oraz radioterapię. Chemioterapia oraz Rtg-terapia wykazują skuteczność u około 10% pacjentów, u których stwierdzo- no przerzuty, a średni okres ich przeżycia nie przekracza 18 miesięcy [1,5]. Po- dobnie brak skuteczności wykazuje szeroko stosowana do niedawna hormonote- rapia [3]. Istniejądane, iż zjawisko to związane może być z obecnością błonowej glikoproteiny P, odpowiedzialnej za ?wypompowywanie” m.in. cytostatyków z komórki. Nerka jest jednym z narządów, których komórki są szczególnie bogate w ten błonowy transporter [6]. Dlatego też, wielu badaczy zwróciło się ku nowo- powstałym metodom terapii nowotworów. Postępy cytofizjologii oraz biologii molekularnej pozwoliły, na przynajmniej częściowe, zrozumienie procesów od- pornościowych zachodzących w organizmie chorego na raka pacjenta. Szczegól- nie prace dotyczą możliwości wykorzystania hodowanych in vitro limfocytów do leczenia zaawansowanego raka nerki ? immunoterapii adaptacyjnej. Obecnie istnieje kilka metod takiego leczenia zależnie od typu wykorzystanych komórek, miejsca ich pobrania oraz sposobu stymulacji i hodowli. Badania te zainicjowane i prowadzone są przez S. Rosenberga od wczesnych lat osiemdziesiątych [7].
Jedna z najbardziej obiecujących metod polega na uzyskaniu z masy guza nacie-
kających go limfocytów, ich hodowli ?in vitro” i po uzyskaniu odpowiedniej ilości i poddaniu dodatkowej stymulacji, przetoczeniu do organizmu chorego pacjenta. Niestety, metoda ta ze względu na wysokie koszty cytokin używanych do pod- trzymania limfocytów T w hodowli zastosowana została tylko u kilkudziesięciu pacjentów, przy czym uzyskano poprawę stanu zdrowia (wyrażonąjako przynaj- mniej częściową regresję guza) u ok. 30% pacjentów.
Kluczowym elementem hodowli jest jedna z cytokin – interleukiną 2 (IL-2).
Jest to glikoproteina będąca najważniejszym czynnikiem podtrzymującym limfo- cyty T cytotoksyczne w hodowli. Zarazem jest ona najdroższym elementem im- munoterapii adaptacyjnej. Celowym wydaje się prowadzenie badań mających na celu optymalizację wa- runków hodowli, aby do podtrzymania cytotoksyczności komórek TIL i ich stałe- go namnażania wystarczały jak najmniejsze ilości IL-2.
MATERIAŁ I METODA
Poszukując źródeł stymulacji w prezentowanych badaniach sięgnąłem po anty-
geny dobrze znane wszystkim urologom, a będące podstawą najpopularniejszej metody immunoterapii nowotworów, szczególnie czerniaka oraz raka przejściowo- komórko-wego pęcherza moczowego. Mowa o liofilizowanych komórkach BCG.
Materiał do hodowli pobierano z guzów nerek operowanych w Oddziale Uro-
logii Szpitala Wojewódzkiego w Bydgoszczy. Użyto komórek pobranych z 8 gu- zów nerek w których badaniem histopatologicznym stwierdzono raka jasnoko- mórkowego.
Z każdego guza pobierano fragment guza o masie 10 g. Po oczyszczeniu z
tkanki tłuszczowej i elementów łącznotkankowych preparat rozdrabniano me- chanicznie a następnie trawiono w 0,25% roztworze trypsyny przez około 50 min. Uzyskana masa, po inaktywacji enzymów, podlegała filtracji przez siatkę nylono- wą. Z mieszaniny komórkowej, oddzielano limfocyty wirując w gradiencie gęsto- ści Ficoll uropolina.
Uzyskane komórki zawieszano w zawiesinie w typowej gęstości 500.000 ko-
mórek/ml. Fenotyp uzyskanych komórek oznaczany był przy pomocy przeciw- ciał anty-CD3 i CD8 znakowanych fluoresceiną. Od 4 dnia do hodowli dodawa- łem po 1000 U/ml IL-2 a do drugiej części każdej hodowli po 500 U/ml IL-2 oraz po 0,5 mg szczepu BCG Instytutu Pasteura o gęstości 7000000 komórek na mg liofilizatu.
IL-2 dostarczona została do hodowli komórek TIL dzięki uprzejmości firmy
Roussel – UCLAF. Badania przeprowadzone zostały z komórkami 8 hodowli, gdzie udało się uzyskać żywotność komórek po 7 dniowej inkubacji. Do oceny aktywności litycznej komórek TIL użyto autologicznych komórek no- wotworowych przechowywanych w płynnym azocie. Po 40 minutowej inkubacji komórek nowotworowych z limfocytami T hodowanymi z II?2 oraz IL- 2 i BCG. Ocena żywotności komórek nowotworowych polegała na ocenie wybarwiania przy pomocy błękitu metylenowego – barwnika barwiącego martwe komórki.
WYNIKI
Uzyskane wyniki przedstawia poniższa tabela.
Ilość komórek uzyskanych z 10 g tkanki każdego guza jest zbliżona w każdej próbce, co więcej odsetek uzyskiwanych komórek o fenotypie limfocytów cyto- toksycznych jest w każdym przypadku podobny. Wielkość lizy autologicznych komórek nowotworowych w obecności komórek TIL zależnie od rodzaju stymulacji przedstawiono w tabeli I.
DYSKUSJA
Wstępna analiza zależności pomiędzy stopniem G a aktywnością lityczną ko-
mórek TIL hodowanych w obecności tylko IL-2 oraz z dodatkiem BCG wykaza- ła iż większy odsetek aktywności w hodowli tylko z IL-2 przypada na limfocyty cytotoksyczne pobrane z guzów mniej zróżnicowanych czyli potencjalnie bar- dziej złośliwych. Natomiast wzrost aktywności po hodowli z IL-2 i BCG jest większy w populacji limfocytów cytotoksycznych pobranych z guzów bardziej zróżnicowanych.
Być może ta wstępna i wymagająca dokładniejszego potwierdzenia obserwa-
cja wskazuje iż limfocyty są silniej stymulowane przez komórki bardziej anapla- styczne co wiązać mogłoby się z ich większym ?odbiegnięciem” od wzorca anty- genowego prawidłowych komórek gospodarza. Wyższy wzrost aktywności po stymulacji IL-2 i BCG wśród limfocytów pobranych z guzów mniej zróżnicowa- nych sugerować może – moim zdaniem – iż limfocyty cytotoksyczne w obecności komórek bardziej anaplastycznych poprzez wspomniane poprzednio silniejsze pobudzenie wykorzystują większą część zdolności litycznych niż komórki z gu- zów wyżej zróżnicowanych.
WNIOSKI
1. Limfocyty naciekające guz hodowane w środowisku z IL-2 i dodatkowo
stymulowane antygenem wykazują wyższą aktywność cytotoksyczną od komó- rek hodowanych tylko z IL-2.
2.Ilość limfocytów cytotoksycznych naciekających guz waha się w wąskich
granicach
3.Odsetek komórek CD3+CD8+ w populacji komórek limfoidalnych guza nerki
waha się w wąskich granicach.
4.Aktywność lityczna komórek TIL jest większa w populacjach uzyskanych z
guzów bardziej anaplastycznych.
5.Wzrost aktywności litycznej po dodatkowej stymulacji antygenowej jest
większa w populacjach uzyskanych z guzów wyżej zróżnicowanych.