PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

NABŁONEK PRZEJŚCIOWY IN SITU I PERSPEKTYWY JEGO HODOWLI IN VITRO DLA CELÓW REPARACYJNYCH
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1999/52/4.

autorzy

Krzysztof H. Włodarski, Paweł Wlodarski, Bolesław Kuzaka
Zakład Histologii i Embriologii Instytutu Biostruktury (KHW, PKW) AM w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. S. Moskalewski
Klinika Urologiczna (BK) AM w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. A. Borkowski

słowa kluczowe

układ narządów moczowych hodowla nabłonka przejściowego

streszczenie

Przedstawiono morfologię i cytofizjologię oraz opisano metodę hodowli
ludzkiego nabłonka dróg moczowych in vitro. Hodowle tych komórek na
biodegradowalnych' podłożach (polimery kwasu poliglikolowego, prepara-
ty bezkomórkowej skóry) mogą być wyzyskane do rekonstrukcji w obrębie
dróg moczowych.

WSTĘP
Chirurgia odtwórcza, w tym urologiczna, potrzebuje metod szybkiego
namnażania in vitro tkanek, najlepiej własnych biorcy, które po przeszcze-
pieniu podejmą swą naturalną funkcję.
Stworzenie w warunkach laboratoryjnych sztucznych naczyń ? śród-
błonka hodowanego na degradowalnych polimerach, sztucznej kości ?
osteoblastów rosnących na kompozytach ceramicznych, czy tez sztucz-
nego moczowodu lub pęcherza moczowego ? nabłonka przejściowego
rosnącego na degradowalnych polimerach z jednej strony, przykrytych
hodowanymi komórkami mięśniowymi z drugiej strony, nie są już fanta-
zją, lecz stają się.iaktami.
Niniejszy przegląd przedstawia możliwości i ograniczenia hodowli
komórek nabłonka dróg moczowych człowieka oraz charakterystykę tych
komórek.
MORFOLOGIA I WŁASNOŚCI BIOLOGICZNE
PRAWIDŁOWEGO NABŁONKA PRZEJŚCIOWEGO (UROTELIUM)
Biologiczne własności prawidłowego nabłonka przejściowego (dróg
moczowych) nie są jeszcze dokładnie scharakteryzowane.
U czteromiesięcznych płodów ludzkich nabłonek pęcherza moczowe-
go składa się z dwóch warstw, a od piątego miesiąca życia płodowego
pojawia się w nim trzecia warstwa komórek. Różnicowanie się luminar-
nej błony komórkowej (tzn. błony komórek tworzących powierzchnię
światła pęcherza) rozpoczyna się już w trzecim miesiącu życia. Wyrazem
tego jest pojawienie się wydłużonych i pofałdowanych struktur błono-
wych, do których przylegają pęcherzyki okryte, oraz obecność wakuoli.
Wakuole te są przejawem funkcji resorpcyjnej i transportującej (transport
jonów) komórek nabłonka warstwy powierzchniowej. Różnicowanie się
nabłonka koreluje z jego dojrzewaniem do funkcjonowania jako bariery
między hipotonicznym moczem a tkankami [15].
Nabłonek pęcherza moczowego osobników dorosłych składa się z kilku
(do siedmiu) warstw komórek, tworzących warstwę podstawną pośred-
nią oraz powierzchniową. Nabłonek trójkąta moczowego składa się
z trzech pojedynczych pokładów komórek, podobnie zróżnicowanych.
Urotelium wykazuje regularną, spolaryzowaną strukturę o wzrastającej
złożoności i zróżnicowaniu od podstawy po powierzchnię.
Komórki warstwy powierzchniowej nigdy nie wykazują bezpośrednie-
go kontaktu z błoną podstawową (w przeciwieństwie do komórek war-
stwy podstawowej i ? sporadycznie ? warstwy pośredniej; jest to więc
typowy nabłonek wielowarstwowy [30], a nie wielorzędowy, jak to w
odniesieniu do pewnych gatunków, sugerują niektórzy autorzy [28].
Jądra sześciennych komórek warstwy podstawowej, szerokości 10-20 um,
mają pofałdowaną błonę jądrową oraz bardzo skondensowaną chroma-
tynę, co wskazuje na ograniczoną aktywność transkrypcyjną
(czyli aktywację genów). Aktywność mitotyczna prawidłowego nabłon-
ka przejściowego jest bardzo niska lub wręcz zerowa [12]. Jost i wsp. [18]
nie zaobserwowali żadnej komórki będącej w fazie mitozy pośród 50 000
ocenianych komórek. U szczurów aktywność mitotyczna nabłonka przej-
ściowego pęcherza moczowego wykazuje rytm dobowy, tzn. zmienia się
z porą dnia i wzrasta po długotrwałym podawaniu związków rakotwór-
czych [12, 32]. Normalny obrót (wymiana) nabłonka przejściowego wy-
nosi około 1 roku, i dlatego można go uznać za najwolniejszy spośród
nabłonków ssaków. Podając jednak systemowo czynnik wzrostu naskór-
ka (keratinocyte growth factor, KGF) przez kilka dni można uzyskać bar-
dzo znaczne przyspieszenie obrotu tego nabłonka u małp, uwidaczniają-
ce się dwukrotnym wzrostem indeksu mitotycznego [37].
Jądra komórek warstwy podstawnej zawierają ciałka jądrowe (niewia-
domej funkcji i pochodzenia) oraz wyraźne jąderka. Mitochondria tych
komórek nie są rozproszone równomiernie w cytoplazmie, lecz występu-
ją w skupiskach. Aparat Golgiego oraz błony szorstkie są w komórkach
warstwy podstawowej bardzo słabo rozwinięte, co świadczy o ich nikłej
aktywności metabolicznej.
Komórki warstwy pośredniej, składającej się z 1-4 pokładów komórek
są większe (15-50 ?m), a struktura jąder komórkowych w warstwie po-
średniej jest analogiczna do struktury jąder komórek warstwy podstaw-
nej ? mają one nieregularny kształt, mają wyraźne jąderka i zawierają
ciałka jądrowe. System Golgiego w tych komórkach jest dobrze rozwinię-
ty i można znaleźć w tych komórkach lizosomy. Mitochondria zlokalizo-
wane są głównie w części szczytowej komórek.
W komórkach warstwy powierzchniowej oś długa komórek biegnie
równolegle do błony podstawnej. Szerokość komórek warstwy powierzch-
niowej wynosi 20-40 ?m. Błona komórkowa tworzy liczne pofałdowania
i wgłobienia, stanowiące tzw. rezerwuar, wykorzystywany podczas roz-
ciągania komórek wskutek nagromadzania się moczu w pęcherzu. Jądra
komórek warstwy powierzchniowej są okrągłe, niekiedy podwójne, za-
wierają luźną chromatynę oraz duże, często podwójne, jąderka. Luźna
chromatyna jądrowa sugeruje wysoki stopień aktywności transkrypcyj-
nej tych komórek. Cechą charakterystyczną komórek warstwy powierzch-
niowej jest obecność dużej liczby dużych lizosomów oraz licznych waku-
oli. Pęcherzyki cytoplazmatyczne komórek warstwy powierzchniowej
podczas rozciągania ściany pęcherza łączą się z błoną komórkową, po-
zwalając na wzrost objętości pęcherza bez zmiany objętości komórek [20].
Morfogeneza tych ?zapasowych” błon komórkowych odbywa się w bocz-
nych obszarach aparatu Golgiego [2]. W zależności od gatunku, około
85-94% błony adluminalnej przechodzi z i do cytoplazmy w postaci dys-
koidalnych pęcherzyków. U gatunków, które bardzo zagęszczają mocz,
takich dyskoidalnych pęcherzyków jest znacznie więcej niż u gatunków,
które produkują mocz znacznie mniej zagęszczony. Ta korelacja świad-
czy o związku błon luminalnych z tonicznością moczu [22].
Także układ Golgiego i układ błon szorstkich w komórkach warstwy
powierzchniowej są dobrze rozwinięte. Komórki warstwy powierzchnio-
wej połączone są pomiędzy sobą połączeniem typu ścisłego (tight junc-
tions). Połączenia tego typu nie są spotykane pomiędzy komórkami in-
nych warstw nabłonka przejściowego. W tych pozostałych warstwach,
komórki połączone są za pomocą zachodzących na siebie wypustek cyto-
plazmatycznych oraz poprzez desmosomy [18].
U ludzi starych (61-82 letnich) w błonie śluzowej pęcherza moczowe-
go można spotkać, obok typowego nabłonka przejściowego, obszary wy-
słane jedynie 1-2 warstwami komórek [17].
Struktura nabłonka przejściowego u zwierząt (świni, owiec, szczurów,
myszy) w zasadzie nie odbiega od schematu budowy nabłonka przejścio-
wego człowieka. Urotelium wymienionych wcześniej zwierząt jest na-
błonkiem wielowarstwowym sześciennym, a różnice między gatunkowe
sprowadzają się do różnic ilościowych w obrębie warstwy pośredniej [11,
29]. Firth i Hicks [11] u wszystkich przebadanych 16 gatunków zwierząt,
w tym człowieka, jako wspólną cechę nabłonków przejściowych opisali
obecność w komórkach warstwy powierzchniowej specyfcznej, grubej
(kanciastej) adluminalnej błony komórkowej oraz dużych autofagosomów.
Także podkreślają oni znaczne różnice w obrębie komórek warstwy po-
średniej. W obrębie tej warstwy u niektórych gatunków pojawiają się blasz-
kowate spiralne struktury, będące prawdopodobnie szczególną formą sia-
teczki śródplazmatycznej.
Nabłonek przejściowy jest bogaty w węglowodany i kwas sialowy. Kwas
sialowy występuje w mukopolidowej osłonce komórek powierzchniowych,
tzw. glikokaliksie, będącym zapewne źródłem mukoprotein Tamma i Hors-
fala [3, 7, 23].
Mukopolisacharydy, dające reakcję PAS-dodatnią, występują w po-
wierzchniowej warstwie nabłonka pęcherza moczowego [21]. Daje
to podstawę do spekulacji, że nabłonek przejściowy ma właściwości wy-
dzielnicze.
Komórki warstwy powierzchniowej nabłonka przejściowego pęcherza
moczowego wykazują dużą aktywność endocytarną, tzn. czynnie pobie-
rają z otoczenia materiał wielkocząsteczkowy. Pobierają one z moczu wiele
substancji o małej i dużej masie cząsteczkowej i transportują ją w kierun-
ku podnabłonkowej tkanki łącznej.
Pomiędzy komórkami nabłonka, a także wewnątrz nich, występują
komórki układu immunologicznego: limfocyty, makrofagi, monocyty
i komórki plazmatyczne oraz, rzadziej, granulocyty obojętnochłonne. Ele-
menty te biorą udział w odpowiedzi immunologicznej na czynniki, wni-
kające do przestrzeni międzykomórkowych nabłonka. Są one także od-
powiedzialne za usuwanie zdegradowanych i starych komórek warstwy
powierzchniowej. Można więc w nabłonku przejściowym pęcherza mo-
czowego wydzielić trzy bariery czynnościowe, chroniące przed szkodli-
wymi czynnikami, obecnymi w moczu czynnikami; są nimi pierwsza struk-
tura samych komórek warstwy powierzchniowej (dobrze rozwinięty układ
lizosomalny i własności pinocytarne); druga ? górne komórki warstwy
pośredniej, oraz trzecia ? komórki zaangażowane w odpowiedź immu-
nologiczną, rezydujące w obrębie nabłonka [14].
Nabłonek pęcherza moczowego może, w odpowiedzi na różne bodźce,
ulegać metaplazji w kierunku nabłonka złuszczającego się, nabłonka rze-
komo wielowarstwowego, walcowatego lub sześciennego [10]. Pochodze-
nie przeważającej części pęcherza moczowego z zatoki moczowo-płcio-
wej (kloaki) może tłumaczyć metaplazję nabłonka przejściowego pęcherza
moczowego w kierunku nabłonka walcowatego, typu jelitowego.
HODOWLE NABŁONKA PRZEJŚCIOWEGO IN VITRO
Hodowle prawidłowych komórek nabłonka pęcherza moczowego osob-
ników dorosłych jest stosunkowo trudno uzyskać, w przeciwieństwie do
hodowli komórek raka pęcherza moczowego ludzkiego [19, 24, 25, 26]
lub zwierzęcego [1].
Stosunkowo najłatwiej jest uzyskać hodowle nabłonka przejściowego
z eksplantatów, tj. rozdrobnionych mechanicznie fragmentów błony ślu-
zowej pęcherza moczowego lub moczowodów, umieszczonych w odpo-
wiedniej pożywce. Po kilku dniach z tych fragmentów wyrastają płytki
nabłonkowe, które można dalej pasażować. Jednak komórki te ulegają
spontanicznej transformacji, tzn. zmieniają swój fenotyp i genotyp, przyj-
mując cechy komórek nowotworowych o różnym stopniu złośliwości.
W ten sposób DeBoer i wsp. [9] wyprowadzili trzy różne linie komórko-
we nabłonka pęcherza moczowego, różniące się morfologią, guzotwór-
czością, liczbą chromosomów oraz ekspresją receptorów dla naskórko-
wego czynnika wzrostu (EGF).
Do celów rekonstrukcji układu moczopłciowego potrzebne są metody
hodowli komórek nabłonka przejściowego pozwalające na szybki wzrost
komórek, pozyskanych ze stosunkowo małego fragmentu tkanki wyjścio-
wej oraz zachowanie ich fenotypu nabłonkowego i możliwości jego doj-
rzewania i różnicowania się po retransplantacji in vivo. Ostatnio kilku
ośrodkom udało się te oczekiwania spełnić.
Cilento i wsp. [8] z 1- 4 cm2 błony pęcherza moczowego dzieci, podda-
nych operacji reimplantacji moczowodów, wyprowadzili hodowle komó-
rek nabłonkowych, które nie zmieniały swego charakteru przez sześć kolej-
nych pasaży, szybko proliferowały, zachowując swój prawidłowy kariotyp,
a po przeszczepieniu in vivo zwierzętom immunologicznie areaktywnym
(myszy bezgrasicze) różnicowały się do wielowarstwowych struktur, przy-
pominających nabłonek błony śluzowej pęcherza moczowego. Z teoretycz-
nych wyliczeń wynika, że z powierzchni 1 cm2 błony śluzowej można, w
ciągu 8 tygodni, uzyskać taką liczbę komórek, która pokryłaby powierzch-
nię 4,2 m2, przyjmując nawet, że podczas każdego pasażowania traci się
aż 50% komórek! Hodowle te prowadzono na pożywce dla komórek na-
skórka (keratynocytów) bez surowicy (tzw. pożywka chemicznie zdefinio-
wana), jednak z dodatkiem kilku czynników wzrostu – wyciągu z przy-
sadki oraz naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
Izolowanie enzymatyczne komórek urotelium z błon śluzowych dróg
moczowych, pobranych od osobników młodych (2 miesiące do 16 lat), a
następnie hodowanych na pożywce dla keratynocytów, wzbogaconej w
czynniki wzrostu, lecz bez surowicy, pozwoliło na szybkie namnażanie
komórek nabłonkowych tak, że już po 7 dniach uzyskiwano murawę (kon-
fluencję) komórek na powierzchni 25 cm2. Stosując odpowiednie markę-
ry Hutton i wsp. [16] wykazali, że populacja komórek w tych hodowlach
ma fenotyp komórek warstw podstawowej i pośredniej oraz że fenotyp
tych relatywnie niezróżnicowanych komórek, szybko proliferujących in
vitro, nie ulegał zmianie przez 7 kolejnych pasaży.
Także z błony śluzowej dróg moczowych dzieci (0,5 -12 lat) udało się w
90% przypadków wyprowadzić hodowle komórek nabłonkowych, które
po początkowo wolnej fazie wzrostu (pełne pokrycie naczyń hodowla-
nych dopiero po 3-4 tygodniach) rosły szybko, osiągając po 2 miesiącach
ponad 2000-krotność liczby komórek wyjściowych podczas 25 pasaży [27].
Autorzy podają, że w ciągu 2 miesięcy można z jednej biopsji pęcherza
moczowego uzyskać około 1000 cm2 powierzchni, pokrytej nabłonkiem.
W tym ośrodku posługiwano się także metodą enzymatycznego uzyski-
wania nabłonka z materiału bioptycznego, a podłoże hodowlane było
wzbogacone o surowicę oraz EGF i inne czynniki mitogenne.
Pomyślne próby hodowania ludzkiego nabłonka przejściowego pozwo-
liły na wyprodukowanie ?sztucznego” pęcherza moczowego czy moczo-
wodu. Enzymatycznie uwolnione komórki urotelium oraz komórki mię-
śniowe pęcherza moczowego (materiał chirurgiczny, nie podano jednak
wieku dawców) hodowano prze 4 dni na podłożu polimeru (kwasu poli-
glikolowego), który ma tę właściwość, że przeszczepiony do organizmu
ulega stopniowej degradacji i resorpcji (tzw. biodegradacja). Komórki na-
błonkowe oraz mięśniowe, posiane na polimerze przylegają doń
i proliferują. Po przeszczepieniu kompozycji polimerowo-komórkowych my-
szom bezgrasiczym, stwierdzono po 50 dniach tworzenie się wielowarstwo-
wych struktur nabłonkowych oraz warstwę mięśniową. Te struktury przy-
pominały swym składem i układem ścianę pęcherza moczowego [6].
Podobne rezultaty uzyskano nieco wcześniej, z zastosowaniem nabłon-
ka pęcherza moczowego królika, posianych na takim samym polimerze.
Po przeszczepieniu zwierzęciu takiego ?rusztowania” nabłonkowo-poli-
merowego, hodowanego in vitro, polimer ulegał stopniowej degradacji,
a implantowane na nim komórki nabłonkowe zachowywały nadaną im
przez sieć polimeru orientację przestrzenną [5].
Zamiast polimeru kwasu poliglikolowego, Gustafson i wsp. [13] użyli
jako podłoża dla hodowli komórek ludzkiego nabłonka przejściowego od-
powiednio spreparowanej skóry, a właściwie bezkomórkowej macierzy
skóry właściwej, naturalnego preparatu, łatwo ulegającego biodegradacji
oraz pozbawionego antygenowości [31].
Izolowane enzymatycznie komórki nabłonka przejściowego miedni-
czek nerkowych i moczowodów namnażano początkowo na warstwie
odżywczej stworzonej z nieproliferujących fibroblastów mysich, a po uzy-
skaniu większej ilości komórek posiewano je na bezkomórkową matrycę
skóry, stanowiącą podłoże dalszego rozrostu nabłonka. Komórki nabłon-
ka tworzyły początkowo wysepki, które rozrastając się, stopniowo po-
krywały całą powierzchnię matrycy, a po 3 tygodniach tworzyły kilku-
warstwową błonę nabłonków.
Rysują się więc całkiem realne perspektywy skonstruowania in vitro
sztucznej ściany pęcherza moczowego lub moczowodu i retransplantacji
go w celach odtwórczych pacjentom, od których.wcześniej pozyskano
fragment błony śluzowej dróg moczowych. Po wyizolowaniu i namnoże-
niu komórek nabłonkowych byłyby one posiewane na biodegradowalne
podłoże (polimery aminokwasów, bezkomórkowa matryca skóry pozba-
wiona antygenowosci). Podłoże takie można od strony przeciwległej na-
błonka pokryć komórkami mięśniowymi lub fibroblastami, pozyskanymi
z tego samego źródła, co urotelium. Tworzywo komórkowo-polimerowe
po przeszczepieniu będzie spełniało funkcję ściany pęcherza lub moczo-
wodu. Po pewnym czasie ulegnie ono waskularyzacji, a polimer lub
?sztuczna skóra” zostaną zresorbowane i zastąpione tkankami własny-
mi gospodarza [4].
Na marginesie tych rozważań o hodowli ludzkich nabłonków przej-
ściowych warto zwrócić uwagę, że w żadnej z cytowanych prac o prze-
szczepianiu ludzkiego nabłonka przejściowego in vivo nie było ani jednej
wzmianki o zaobserwowaniu indukcji osteogenezy. Nabłonek przejścio-
wy wielu (lecz nie wszystkich!) gatunków zwierząt, przeszczepiony do-
mięśniowo ma własności wywoływania kościotworzenia (przegląd lite-
ratury z tego zakresu w [33]). Jeszcze do niedawna panował, oparty raczej
na przypuszczeniach niż badaniach eksperymentalnych, pogląd, że na-
błonek dróg moczowych człowieka jest zdolny do indukcji osteogenezy.
Prace naszego zespołu udowodniły, że tak nie jest [34,35,36], co jest zresztą
bardzo korzystną sytuacją z punktu widzenia chirurgii na drogach mo-
czowych człowieka. Brak wzmianek o obecności tkanki kostnej w sąsiedz-
twie przeszczepianego ludzkiego nabłonka przejściowego myszom bez-
grasiczym jest kolejnym i niezależnym (choć niezamierzonym) dowodem
na słuszność naszego stanowiska.

piśmiennictwo

  1. [1] Allen, G. R, Bryans, J. T.: Studies of an established equine cell line derwedfrom
  2. transitional cell carcinoma. Am. J. Vet. Res. 1974,35,1153-1160.
  3. [2] Alroy, J., Merk, F. B., Morre, D. ]., Weinstein, R. S.: Membrane differentiation
  4. in the Golgi apparatus ofmammalian urinary bladder epithelium. Anat. Rec. 1982,
  5. 203, 429-440.
  6. [3] Alroy, ]., Goyal, V., Ucci, A. A., Klauber, G. T., Heaney, J. A., Cohen, S. M.:
  7. Cell surface coat of human and rat bladder urothelium. I. Ruthenium-red studies in
  8. non-neoplastic and neoplastic cells. Virchows Arch. B (Cell Pathol.) 1983,42,251-
  9. 262.
  10. [4] Atala, A.: Commentary on the replacement of urologic associated mucosa. J. Urol.
  11. 1996, 156, 338-339.
  12. [5] Atala, A., Vacanti, J. R, Peters, C. A., Mandell, J., Retik, A. B., Freeman
  13. A. R.: Formation of urothelial structures in vivo from dissociated cells attached to
  14. biodegradable polymer scaffolds in vitro. J. Urol. 1992,148, 658-662.
  15. [6] Atala, A., Freeman, M. R., Vacanti, J. R, Shepard, }., Retik, A. B.: Implan-
  16. tation in vivo and retrieval of artificial structures consisting of rabbit and human
  17. urothelium and human bladder muscle. J. Urol. 1993,150, 608-612.
  18. [7] Candiotti, A., Ibanez, N., Monis, B.: Carbohydrate content of transitional epi-
  19. thelium of the urinary system. Experient. 1971, 27, 551-552.
  20. [8] Cilento, B. G., Freeman, M. R., Schenck, F. X., Retik, A. B., Atala, A.:
  21. Phenotypic and cytogenetic characterization of human bladder urothelia expanded in
  22. vitro. J. Urol. 1994,152, 665-670.
  23. [9] DeBoer, W. I., Rebel, J. M. }., Foekens, J. A., Vermey, M., Van der Kwast,
  24. T. H.: Characterization of mouse urothelial cell lines in different phases of transition-
  25. al-cell carcinogenesis. Int. J. Cancer. 1993, 54,1022-1027.
  26. [10] De la Pena, A., Oliveros, M., Tamames, J. M., Mintz, S.: Neoplastic and
  27. malignant changes of the urothelium. Br. J. Urol. 1959,31,473.
  28. [11] Firth, J. A., Hicks, R. M.: Interspecies variation in the fine structure and enzyme
  29. cytochemistry ofmammalian transitional epithelium. J. Anat. 1973,116, 31-43.
  30. [12] Fukushima, S., Arai, M., Cohen, S. M., Jacobs, J. B., Friedell, G. H.: Scan-
  31. ning electron microscopy of cyclophosphanmide-induced hyperplasia of the rat uri-
  32. nary bladder. Lab. Investig. 1981, 44, 89-96.
  33. [13] Gustafson, C. J., Eldh, J., Kratz, G.: Culture of human urothelial cells on a cell-
  34. free dermis for autotransplantation. Eur. Urol. 1998, 33, 503-506.
  35. [14] Holstein, A. F., Sandmann, }., Bressel, ML, Davidoff, M. S.: Reinvestiga-
  36. tion of the transitional epithelium (urothelium) of human ureter. Ann. Anat. 1994,
  37. 176, 109-117.
  38. [15] Hoyes, A. D., Ramus, N. L, Martin, B. G. H.: Fine structure of the epithelium
  39. of the human fetal bladder. J. Anat. 1972,11, 415-425.
  40. [16] Hutton, K. A. R., Trejdosiewicz, L. K., Thomas, D. F. M., Southgate, J.:
  41. Urothelial tissue culture for bladder reconstruction: an experimental study. J. Urol.
  42. 1993 , 150, 721-725.
  43. [17] Jacob, J., Ludgate, C. M., Forde, J., Tulloch, W.: Recent obserations on the
  44. ultrastructure of human urothelium. 1. Normal bladder of elderly subjects. Cell
  45. Tiss. Res. 1978,193, 543-560.
  46. [18] Jost, S. P., Gosling, J. A., Dixon, J. S.: The morphology of normal bladder
  47. urothelium. J. Anat. 1989,167,103-115.
  48. [19] Kirkels, W. J., Pelgrim, O. E., Debruyne, F., Vooijs, G. R, Herman, C. J.:
  49. Soft agar culture of human transitional cell carcinoma colonies from urine. Am. J.
  50. Clin. Pathol. 1982, 78, 690-694.
  51. [20] Lewis, S. A., de Moura, L. C: Incorporation of cytoplasmic vesisles into apical
  52. membrane ofmammalian urinary bladder epithelium. Nature. 1982,297,685-688.
  53. [21] Mende, T., Chambers, E.: Distribution of mucopolisacharide and alkaline phos-
  54. phatase in transitional epithelium.}. Histochem. Cytochem. 1957,5,99.
  55. [22] Minsky, B. D., Chlapowski, F. }.: Morphometric analysis of the translocation of
  56. lumenal membrane between cytoplasm and cell surface of transitional epithelial cells
  57. during the expansion-contraction cycles ofmammalian urinary bladder. J. Cell Biol.
  58. 1978, 77, 685-697.
  59. [23] Monis, B., Zambrano, D.: Ultrastructure of transitional epithelium of man. Ztsch
  60. Zellforsch. 1968, 87, 101-117.
  61. [24] Ostrowski, K., Kieler, ]., Balslev, I.: Differences in adhesion of urothelial cells to
  62. a panel of substrates are characteristic for established human urothelial cell lines
  63. differing in their transformation grade. Anticancer Res. 1990,10, 359-368.
  64. [25] OToole, C. M., Tiptaft, R. C, Stevens, A.: HLA antigen expression on urothe-
  65. lial cells: detection by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. Int. J. Cancer.
  66. 1982, 29, 391-395.'
  67. [26] CToole, C. M., Povey, S., Hepburn, R, Franks, L. M:. Identity of some human
  68. bladder cancer cell lines. Nature. 1983, 301, 429-430.
  69. [27] Pletzold, J. L., Leigh, 1., Duffy, P. G., Masters, J. R. W.: Culture and charac-
  70. terization of human urothelium in vivo and in vitro. Urol. Res. 1994, 22: 67-74.
  71. [28] Sawicki, W-; Histologia, wyd. II. PZWL. Warszawa 1997, 93.
  72. [29] Scheidegger, G.: Der Aufbau des Ubwergangsepithels der Harnblase bei Schwein,
  73. Schaf Ratte und Spitznmaus. Acta Anat. 1980,107, 268-275.
  74. [30] Scheidegger, G., Ludwig, K. S.: Ultrastructural study of the transitional epithe-
  75. lium of the common. European white-toothed shrew (Crocidura russula). Experien.
  76. 1977, 33, 1507-1509.
  77. [31] Takami, Y., Matsuda, T., Yoshitaka, M., Hanumadass, M., Walter, J.:
  78. Dispase/detergent treated dermal matrix as dermal substitute. Burns. 1996,22,182-
  79. 190.
  80. [32] Tiltman, A. J., Friedell, G. H.: Effect of feedinf N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-
  81. thiazolyl]fornmamide on mitotic activity of rat uńnary-bladder epithelium. J. Nat.
  82. Cancer Inst. 1972, 48,125-129.
  83. [33] Wlodarski, K. H.: Bone formation in soft tissues, Bone (ed) Hall B. K., vol. 5,
  84. Fracture repair and regeneration. Boca Raton, CRC Press. 1992,313-337.
  85. [34] Wlodarski, K. H., Kuzaka, B., Wlodarski, R: Species differences in uroepithe-
  86. lium-induced bone deuelopment: obserations on transplants of human uroepitheli-
  87. um in cortisone-treated mice. Eur. Urol. 1995, 27,227-231.
  88. [35] Wlodarski, K. H., Kuzaka, B., Wlodarski, R K., Torz, C: Is heterotopic bone
  89. formation, occuring near a cut ureter, a sign of osteoinductive potency of human
  90. urothelium? Urol. Int. 1995, 55,115-117.
  91. [36] Wlodarski, K. H., Kuzaka, B., Wlodarski, P. K.: Human urinary bladder-
  92. carcinoma cells are nonosteoinductive. World J. Urol. 1996,14, S16-S20.
  93. [37] Yi, E. S., Shabiak, A. S., Lacey, D. L., Bedoya, A. A., Yin, S., Housley, R.
  94. M., Danilenko, D.M., Benson, W., Cohen, A. M., Pierce, G. F., Thomson,
  95. A., Ulich, T. R.: Keratinocyte growth factor causes proliferation of urothelium in
  96. vivo. J. Urol. 1995,154,1566-1570.