PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

BADANIE BIAŁKA ZAWARTEGO W MACIERZY ORGANICZNEJ KAMIENI MOCZOWYCH
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1999/52/4.

autorzy

Waldemar Różański, Stanisław Sypniewski, Zbigniew Górkiewicz, Eugeniusz Miękoś, Tadeusz Paryjczak
Klinika Urologii ICH WAM w Łodzi
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. E. Miękoś
Instytut Chemii Ogólnej i Ekologicznej Politechniki Łódzkiej w Łodzi
Dyrektor Instytutu: prof. zw. dr hab. T. Paryjczak

słowa kluczowe

układ moczowy kamica moczowa macierz organiczna białka

streszczenie

Wstęp. Jak dotąd nie jest wyjaśniona rola macierzy organicznej w procesie
powstawania i przyrostu masy kamieni moczowych. Celem pracy jest cha-
rakterystyka mas cząsteczkowych białek zawartych w macierzy organicz-
nej różnych kamieni moczowych.
Material i metoda. Materiał stanowi 17 kamieni uzyskanych operacyjnie od
chorych leczonych z powodu kamicy nerek. Białko izolowano z kamieni za
pomocą dializy w roztworze wersenianu dwusodowego. Analizę uzyska-
nych białek prowadzono techniką chromatografii wykluczania na kolum-
nie żelowej Superdex 75. Budowę krystaliczną kamieni oznaczano za po-
mocą dyfraktometru rentgenowskiego D 5000 firmy Siemens.
Wyniki. Uzyskano trzy rodzaje kamieni: 1. Bogate w białka charakteryzu-
jące się dużą i średnią zawartością białek o masie powyżej 60 kDa.
2. Ubogie w białka o masie powyżej 60 kDa, lecz zawierające białka
o cząsteczkach od 10 do 60 kDa. 3. Ubogie w białka o masie cząsteczko-
wej powyżej 10 kDa.
Wnioski. Opierając się na wykonanych przez nas badaniach przypusz-
czamy, że wielkość cząsteczki białka zawartego w macierzy kamieni mo-
czowych nie jest jednakowa. Kamienie moczowe o różnej budowie krysta-
licznej zawierają różne ilości białka w macierzy organicznej.

WSTĘP
Wielu naukowców próbuje wyjaśnić proces powstawania kamieni mo-
czowych i rolę jaką w nim odgrywa macierz organiczna oraz substancje
białkowe zawarte w moczu chorych na kamicę. Powstaje wiele pytań
związanych z budową macierzy organicznej: czy jest ona taka sama
we wszystkich kamieniach? Czy w moczu występują takie same białka
jak w macierzy organicznej? Czy białka te występują w moczu ludzi zdro-
wych? Czy białka zawarte w macierzy organicznej wpływają na orga-
nizm chorego? [1, 7, 8,10,11,12].
Macierz organiczna w kamieniach zawierających sole wapnia stanowi
od 2% do 5% masy kamienia. W złogach fosforanowych powstających przy
współistniejącym zakażeniu dróg moczowych macierz może stanowić więk-
szy procent suchej masy kamienia. Macierz organiczną można podzielić
na bezpostaciową pierwotną masę sklejającą pierwsze kryształy w jądrach
krystalizacji i upostaciowaną w formie licznych taśm wnikających głęboko
pomiędzy kryształy lub płaskich kożuchów pokrywających powierzchnie
kryształów. Macierz bezpostaciowa zawiera siarczan chondroityny A, B,
C oraz siarczan heparyny. Macierz upostaciowana zawiera kwas sialono-
wy i hialuronowy [14,15]. Nishio i wsp. [9] badali, z jakim rodzajem krysz-
tałów łączą się poszczególne glikoaminoglikany i stwierdzili, że kamienie
zbudowane z apatytu i struwitu zawierają w macierzy organicznej, kwas
hialuronowy. Kamienie zbudowane z jednowodnego szczawianu wapnia
i kwasu moczowego zawierają siarczan heparyny. Natomiast w macierzy
kamieni zbudowanych z dwuwodnego szczawianu wapnia znajduje się
kwas hialuronowy i siarczan heparyny. Bowyer [2] przypuszcza, że siar-
czan chondroityny jest inhibitorem krystalizacji szczawianu wapnia.
Analizując budowę krystaliczną kamieni moczowych stwierdza się,
że około 70% z nich zawiera sole wapnia. Poza szczawianami w skład
kamieni moczowych mogą wchodzić fosforany, moczany i czysty kwas
moczowy. Wszystkie te sole w moczu ludzi zdrowych występują w postaci
zdysocjowanej, i tylko w określonych warunkach ulegają krystalizacji.
Analizując informacje zawarte w piśmiennictwie można wyłonić grupę
substancji białkowych występujących w moczu lub w macierzy organicz-
nej, mających wpływ na powstawanie i przyrost kamieni moczowych. Wy-
mienia się następujące substancje białkowe: białko Tamma-Horsfalla, oste-
opontyna, nefrokalcyna, uropontyna, litostatyna, nefropontyna (podobna
do osteopontyny), kwas uronowy bogaty w białko, protrombina fragment
1, glikozaminoglikany takie jak: siarczan heparyny, siarczan chondroityny
A, B, C, kwas sialonowy, kwas hialuronowy [1, 3, 5, 7, 8,12,14,15].
Celem pracy jest charakterystyka substancji białkowych zawartych
w macierzy organicznej różnych kamieni moczowych na podstawie ich
mas cząsteczkowych.
Materiał stanowi 17 kamieni uzyskanych operacyjnie od chorych le-
czonych z powodu kamicy moczowej w Klinice Urologii WAM w Łodzi.
METODA BADAŃ
Opierając się na dotychczas opublikowanych wynikach opracowano
metodę separacji i analizy białek i ich pochodnych występujących w ka-
mieniach moczowych za pomocą chromatografii wykluczania (SEC).
Ze względu na małą stabilność badanych roztworów, jak również złożo-
ność macierzy organicznej i charakter próbki, analiza badanych prepara-
tów obejmowała dwa etapy:
1.Przygotowanie próbki obejmowało wyizolowanie białek z macierzy
kamieni moczowych oraz usunięcie z badanego roztworu niepożądanych
związków. Na tym etapie analizy zastosowano metodę dializy roztworem
wersanianu dwusodowego uważaną za skuteczną i chemicznie bezpiecz-
ną formę przygotowania próbki do dalszej analizy. Próbki kamieni rozcie-
rano w moździerzu w celu otrzymania jednorodnego proszku.
5-gramową naważkę poddawano 48-godzinnej dializie roztworem 0,2 M
EDTA (pH = 7), a następnie 0,2 M NaCl w ciągu 3 dni. Dializę prowadzo-
no w woreczkach dializacyjnych w temperaturze 8°C. Podczas procedu-
ry utrzymywano stałą objętość roztworu w woreczku. Obecność białka
uzyskanego tą drogą oznaczano metodą Lawrego. W 17 badanych ka-
mieniach uzyskano od 0,21 do 5,5 mg białka/gram kamienia, średnio 1,94
mg białka/na gram kamienia (tabela 1).
2.Końcową analizę próbki prowadzono techniką chromatografii wy-
kluczania na kolumnie żelowej Superdex 75 w układzie izokratycznym
z detekcją UV-Vis. W analizie wykorzystano zestaw do chromatografii
cieczowej firmy Pharmacia LKB, składający się z pompy izokratycznej
Pump 2248, detektora UV-Vis-VWM 2141, automatycznego dozownika
próbek Autosampler 2157 oraz integratora C-R5A firmy Shimadzu.
Analizę budowy krystalicznej kamieni moczowych prowadzono za
pomocą dyfraktometru rentgenowskiego D 5000 firmy Siemens.
WYNIKI
W pierwszym etapie badań chromatograficznych ustalono optymalne
warunki rozdziału dla standardowych roztworów białek (Blu Dextran
2000 kDa, Aprotinin 6,5 kDa, Carbonic Anhydrase 12,4 kDa, Cytohrome
C 29 kDa) oraz witaminy K3 Zbadano wpływ zmiany pH oraz siły jono-
wej fazy ruchomej (0,02 M bufor fosforanowy) na retencję, efektywność
separacji oraz rozdzielczość. Stwierdzono, że w zakresie pH od 3 do 9
zmiana pH fazy ruchomej ma istotny wpływ na efektywność rozdziału
białek (pole powierzchni i wysokość pliku) oraz rozdzielczość. W bada-
nym zakresie pH, kwasowość fazy ruchomej nie miała wpływu na reten-
cję analizowanych związków. Dalszy wzrost separacji osiągnięto poprzez
wysalanie fazy ruchomej odpowiednią ilością chlorku sodowego (wzrost
siły jonowej). W wyniku badań ustalono optymalny dla rozdzielanych
składników następujący skład fazy ruchomej: 0,02 M bufor fosforanowy
0,5 M NaCl; pH = 7,0 (ryc. 1 a, b).
Kalibrację metody przeprowadzono z krzywej kalibracji, opierając się
na zależności logarytmu masy cząsteczkowej białka od jego czasu reten-
cji. Krzywą kalibracyjną wyznaczono na podstawie chromatogramów
czterech roztworów białek (ryc. 1 c). Na podstawie otrzymanych wyni-
ków wyznaczono statystykę kalibracji. Błąd względny oznaczenia masy
cząsteczkowej zawierał się w granicach 3,5% dla cytohromu C, 23,1%
dla aprotininu. Wyznaczoną krzywą kalibracji wykorzystano do jakościo-
wej oceny zawartości białek w badanych preparatach. 100 mikrolitrów
roztworu nie dializowanych białek wprowadzono do układu chromato-
graficznego. Analizę chromatograficzną prowadzono przy analitycznej
długości fali detektora UV-Vis lambda = 270 nm i 220 nm.
Opracowana metoda analityczna umożliwiła sklasyfikowanie badanych
17 preparatów, w zależności od rodzaju i stężenia, na trzy rodzaje pró-
bek (ryc. 2 b, c).
1.Kamienie bogate w białka, charakteryzujące się szczególnie dużą
i średnią zawartością białek o masie cząsteczkowej powyżej 60 kDa. Gru-
pę tę stanowiło 11 kamieni (ryc. 2a).
2.Kamienie z małą i bardzo małą zawartością białek powyżej 60 kDa,
lecz porównywalną zawartością białek średnio cząsteczkowych od 10 do
60 kDa. Grupę tę stanowiły 3 kamienie (ryc. 2b).
3.Kamienie ubogie w białka o masie cząsteczkowej powyżej 10 kDa.
Grupę tę stanowiły 3 kamienie (ryc. 2c).
DYSKUSJA
Przeprowadzone przez nas badania wykazały występowanie w ma-
cierzy organicznej kamieni moczowych białek o różnej masie cząstecz-
kowej. W tym samym kamieniu może znajdować się kilka cząsteczek
białek o różnych masach cząsteczkowych. Jones i Resnik [6] w wykona-
nej elektroforezie białek z macierzy organicznej wykazali obecność czą-
steczki białka o masie 17,5 kDa. Autorzy ci podają, że mapy proteino-
gramów z macierzy organicznej i moczu chorych były podobne w
kamieniach o różnej budowie krystalicznej. Powstające w odcinku gru-
bym pętli Henlego białko Tamma-Horsfalla obserwowane jest w jej czę-
ści wstępującej i dystalnej krętej części nefronu. Białko to zmienia wła-
sności w zależności od pH moczu. W środowisku alkaicznym słabiej
blokuje przyrost i agregacje kryształów. Atmani i wsp. [1] stwierdzili, że
spadek aktywności białka następuje przy wzroście siły jonowej i obni-
żeniu pH moczu. W tych warunkach następuje jego żelifikacja. Fraij [4]
stwierdził, że białko Tamma-Horsfalla może stanowić do 40% białka
zawartego w macierzy organicznej. Istnieją przypuszczenia, że ma ono
wpływ na proces agregacji kryształów [12]. Według Torbena [13] białka
uzyskane z macierzy organicznej kamieni moczowych swą budową przy-
pominają cząsteczki hemoglobiny, a dotyczy to białek o cząsteczce oko-
ło 14 kDa. Białka o masie 30 kDa uzyskiwał ze złogów powstających w
zakażonym moczu, a obecność elastazy mogła sugerować pochodzenie
tego białka z rozpadających się komórek granulocytów obojętnochłon-
nych.
Należy zwrócić uwagę na możliwość występowania bakterii w ma-
cierzy organicznej kamieni powstających w wyniku infekcji dróg mo-
czowych. Osteopontyna o masie cząsteczkowej od 31 do 45 kDa hamu-
je powstawanie kryształów hydroksyapatytu [5,12]. In vitro hamuje
powstawanie jąder jednowodnego szczawianu wapnia. Nefrokalcyna
jest prawdopodobnie inhibitorem wytrącania się szczawianu wapnia.
Istnieje przypuszczenie, że jest to fragment interalfa-trypsyny. Zarów-
no nefrokalcyna jak i interalfa-trypsyna izolowane są z kamieni, jednak
podczas tego “procesu mogą one ulegać degradacji [7, 8]. Uropontyna
jest bardzo podobna do osteopontyny. Badania in vitro wykazały hamo-
wanie przez nią tworzenia się zarodków szczawianu wapnia i ich agre-
gacji i wzrostu [12]. Kwas uronowy bogaty w białko (UPA) o masie czą-
steczkowej 35 kDa uzyskany z moczu ludzi i szczurów jest taki sam.
Sekwencja pierwszych 18 aminokwasów od końca N-terminalnego jest
homologiczna z Bikuiną inhibitorem interalfa-trypsyny, co sugeruje, że
UPA może być częścią interalfa-trypsyny. Interalfa-trypsyna jest biał-
kiem osocza biorącym udział w procesach zapalnych, chorobach nowo-
tworowych i niektórych chorobach nerek. UPA poddany działaniu en-
zymów traci całkowicie zdolność hamowania krystalizacji [1].
Przedstawione przez nas wyniki potwierdzają występowanie w ma-
cierzy organicznej białek o masach cząsteczkowych podobnych do przed-
stawionych przez cytowanych zarówno we wstępie, jak i w dyskusji au-
torów. Dlatego na tym etapie naszych badań nie próbujemy opisywać
oddzielnie uzyskanych białek: jest to tematem naszych dalszych badań.
Badania nasze potwierdzają obserwacje Atmaniego [1] oraz z Tiseliusa
[12], którzy uważają, że należy ujednolicić modele badawcze, w celu uzy-
skiwania porównywalnych wyników. Ułatwi to określenie roli substancji
białkowych zawartych w macierzy organicznej kamieni moczowych
i moczu chorych na kamicę, klasyfikując je jako inhibitory, promotory lub
substancje obojętne w procesie krystalizacji.
WNIOSKI
1.Przeprowadzone przez nas badania wykazały, że wielkość cząstecz-
ki białka zawartego w macierzy kamienia moczowego nie jest jednako-
wa.
2.Kamienie moczowe o różnej budowie krystalicznej zawierają różne
ilości białka w macierzy organicznej.

piśmiennictwo

  1. [1] Atmani, F., Lacour, B., Daudon, M.: Uronic-acid-rich protein: une nouvelle
  2. glycoproteine inhibitrice de la cristallisation del'oxalate de calcium in vitro. Nephrol.
  3. 1996,17, 157-162.
  4. [2] Bowyer, R. C, Brockis, J. G, McCulloch, R. K.: Glycosaminoglycans as
  5. inhibitors of calcium oxalate crystal growth and aggregation. Clin. Chim. Acta.
  6. 1979, 95, 23-28.
  7. [3] Coe, F. L, Parks, J.: Defenses of an unstable compromis: Crystalization inhibitors
  8. and the kidney's role in minerał regulation. Kid. Int. 1990, 38, 625-661.
  9. [4] Fraij, B. M.: Separation and identification of urinary proteins and stonematrix
  10. proteins by mini-slab sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophroresis.
  11. Clin. Chem. 1989, 35, 658-662.
  12. [5] Jayashree, A., Gokhale, Oatricia, A., Glenton, Saeed, R., Khan.:
  13. Localization of Tamm-Horsfall protein and osteopontin in rat nephrolithiasis model.
  14. Nephron.1996, 73, 456-461.
  15. [6] Jones, W. T, Resnick, M. J.: The characterization ofsoluble matrix proteins in
  16. selected human renal calculi using two-dimensional polyacrylamide gel clectrophoresis.
  17. J. Urol. 1990, 144, 1010-1014.
  18. [7] Nakagawa, Y., Abram, V. Kezdy, F. J., Kaiser, E. T., Coe, F. L.: Purification
  19. and characterization of the principal inhibitor of calcium oxalate monohydrate crystal
  20. growth in human urine. J. Biol. Chem. 1983, 258,12594-12600.
  21. [8] Nakagawa, Y., Ahmed, M. A., Hall, S. L., Deganello, S., Coe, F. L.: Isolation
  22. from human calcium oxalate renal stones of nephrocalcin, a glycoprotein inhibitor of
  23. calcium oxalate crystal growth. Evidence that nephrocalcin from patients with oxalate
  24. nephrolithiasis is deficient in gamma-carboxyglutamic acid. J. Clin. hwest. 1987,
  25. 79, 1782-1787.
  26. [9] Nishio, S., Abe, Y., Wakasuki, A., Iwata, H., Ochi, K., Takeuchi, M.,
  27. Matsumoto, A.: Matrix glycosaminoglycanin urinary stones. J. Urol. 1985,134,
  28. 503.
  29. [10] Rose, M. -B-; Renal stone formation: The inhibitory effect of urine on calcium oxalate
  30. precipitation. hwest. Urol. 1975,12, 428-433 .
  31. [11] Różański, W., Miękoś, L., Klimek, L.: Próby uwidocznienia włókien macierzy
  32. organicznej kamieni moczowych w wyniku chemiolizy in vitro przy pomocy
  33. preparatów fitolizyna i rubiolizyna. Urol. Pol. 1989, 42, 97-103.
  34. [12] Tiselius, H. G.: Macromolecular substance - their role in urolithiasis. Current
  35. Opinion in Urology. 1997, 7, 234.
  36. [13] Torben, E., Petersen, J. D. A., Thogersen and Steffen, E., Petersen:
  37. Identification containnig kidney stones. J. Urol. 1989,142,176-180.
  38. [14] Wakatsuki, A., Nishio, S., Iwata, H., Ochi, K., Takeuchi, M., Matsumoto,
  39. A.: Possible role of hyaluronate in experimental stone formation on rabbits.
  40. J. Urol. 1985,133, 319-323.
  41. [15] Varma, J. S.: Matriz calculus anuria. Brit. J. Urol. 1987,59,190-191.