BIAŁKO p53 W RAKACH PĘCHERZA MOCZOWEGO DONIESIENIE WSTĘPNE
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2000/53/1.

Rak przejściowokomórkowy pęcherza moczowego jest, po raku ster-
cza, najczęściej spotykanym nowotworem układu moczowego w Polsce
i jest przyczyną ponad 2000 zgonów rocznie [21]. Około 80% pacjentów
z pierwotnym rakiem pęcherza moczowego są to pacjenci z guzem po-
wierzchownym, ograniczonym do błony śluzowej pęcherza. Ryzyko
nawrotu po, zastosowanej elektroresekcji przezcewkowej sięga 70% [18],
a prawie 30% guzów nawrotowych ulega progresji. U części pacjentów
(15-30%) nowotwór w chwili rozpoznania jest guzem inwazyjnym i je-
żeli nie zostanie zastosowane leczenie radykalne, u ponad połowy z nich
rozwiną się przerzuty w ciągu 2 lat [18]. Podjęcie właściwej decyzji tera-
peutycznej wymaga dokładnego określenia biologicznego charakteru i
potencjału guza. Współcześnie strategię terapeutyczną dyktują jedynie
stopień zaawansowania klinicznego i zróżnicowania histopatologiczne-
go, pomimo że są to parametry nieprecyzyjnie określone i subiektywne.
Te niedoskonałości w diagnostyce i prognozowaniu w nowotworach
pęcherza moczowego są przyczyną intensywnych poszukiwań nowych
wskaźników prognostycznych, szczególnie w dziedzinie biologii mole-
kularnej. Zastosowanie markerów molekularnych, określających biolo-
giczny potencjał guza, powinno nie tylko precyzyjnie ustalić charakter
choroby, ale również ułatwić selekcję pacjentów: zidentyfikować pacjen-
ta, który może odnieść korzyść z terapii adjuwantnej, kogo zakwalifiko-
wać do nieradykalnego leczenia, a kogo poddać leczeniu bardziej agre-
sywnemu.
W Klinice Urologii we Wrocławiu od kilku lat w diagnostyce guzów
pęcherza moczowego stosujemy w codziennej praktyce klinicznej, oprócz
klasycznych czynników prognostycznych, również ploidię DNA określa-
ną cytofluorymetrycznie w popłuczynach i tkankach. Wskaźnik ten wy-
daje się spełniać stawiane w takim wypadku wymagania, jest stosunkowo
prosty do oznaczenia, obiektywny, powtarzalny, a materiał do badania
uzyskiwany jest w sposób akceptowany przez chorego [6, 7]. Materiał ten
nie zawsze jednak nadaje się do badania metodą cytofluorymetryczną,
bowiem często bywa zanieczyszczony krwią, z dużą ilością komórek od-
czynu zapalnego, jak i komórkami martwymi, co znacznie ogranicza do-
kładność tej metody. Wobec powyższego wskazane byłoby ustalenie jesz-
cze jednego, spełniającego wymienione powyżej warunki, czynnika
prognostycznego. Białko p53 zdaje się spełniać te oczekiwania, a ponad-
to ze względu na szczególną rolę, jaką pełni gen p53 w regulacji cyklu
komórkowego, białko to może służyć jako marker odpowiedzi na zasto-
sowane leczenie: immuno- i chemioterapię.
Gen p53 jest genem supresorowym, który poprzez produkowane biał-
ko p53 wstrzymuje podział komórek w cyklu komórkowym, umożliwia-
jąc proces naprawy DNA lub wprowadzenia komórki w proces progra-
mowanej śmierci – apoptozy. Białko p53 jest czynnikiem determinującym
proces transkrypcji. Wiąże się ono z regionem promotorowym danego
genu, wpływając w ten sposób na jego ekspresję. Prawidłowe tzw. ?dzi-
kie” białko p53 charakteryzuje się bardzo krótkim okresem półtrwania i
dlatego też wykrycie go w tkankach przy zastosowaniu popularnych me-
tod histochemicznych nie jest możliwe [2]. W nowotworach złośliwych
dochodzi do inaktywacji białka p53, co prowadzi do niekontrolowanego
podziału komórki. Zjawisko to może być zarówno efektem mutacji w ob-
rębie genu p53, jak i rezultatem związania się białka p53 z transformacyj-
nymi białkami wirusów onkogennych. W wyniku mutacji ulega upośle-
dzeniu funkcja białka p53, a okres jego półtrwania ulega przedłużeniu [2],
W wielu pracach wykazano, że nadprodukcja stabilnego białka p53, będą-
ca rezultatem mutacji genu p53, wykazuje związek z rozwojem wielu no-
wotworów, w tym pęcherza moczowego i stercza [11, 14-16]. Ponadto,
biorącąc pod uwagę fakt, że śmierć komórek występująca w trakcie che-
mioterapii, immunoterapii lub radioterapii związana jest z procesem apop-
tozy zależnym od genu p53, ekspresja genu p53 powinna być doskona-
łym wskaźnikiem powodzenia ewentualnej terapii adjuwantowej [9].
Celem pracy było określenie ekspresji zmutowanego genu poprzez
oznaczenia białka p53 w rakach pęcherza moczowego oraz poszukiwa-
nie zależności między obecnością białka p53 i ploidią DNA a klasyczny-
mi czynnikami.prognostycznymi: stopniem zaawansowana klinicznego
i zróżnicowania histopatologicznego. Podjęto również próbę określenia
związku między pojawieniem się ekspresji białka p53 a przebiegiem cho-
roby: ilością nawrotów i progresją.
MATERIAŁ
Badaniami objęto 32 chorych z nowotworami pęcherza moczowego
leczonych w Klinice Urologii we Wrocławiu w latach 1992-1994. Średni
czas obserwacji wynosił 79,2 miesiące, a średnia wieku pacjentów 61 lat.
W badaniach analizowano materiał archiwalny, jakim były popłuczy-
ny, tkanki guza i śluzówki pęcherza przechowywane w stanie zamro-
żenia w ciekłym azocie. Stopień zaawansowania nowotworu ustalano
wg systemu TNM [17, 19], opierając się na badaniu klinicznym, w tym
na badaniu oburęcznym w znieczuleniu, cystoskopii, badaniu histopa-
tologicznym, ultrasonografii przezpowłokowej i urografii. U wszyst-
kich chorych oceny histopatologicznej preparatów dokonała dr med.
Elżbieta Górzyńska z Zakładu Histopatologii Wojewódzkiego Szpitala
Zespolonego we Wrocławiu. Dokonywano oceny stopnia złośliwości
w zakresie od Go do G3. Ustalano też histopatologicznie stopień nacie-
kania guza w skrawkach uzyskanych po elektroresekcji guza lub po
wykonanej cystektomii. Badano materiał pobrany od 20 pacjentów z
guzami powierzchownymi, stopniu zaawansowania TaT1 oraz od 12
pacjentów z guzami naciekającymi T2-T4. Podział chorych wg stopnia
zaawansowania nowotworu z uwzględnieniem stopnia złośliwości
przedstawiono w tabeli I.
Osad uzyskany po odwirowaniu popłuczyn, oraz uzyskany materiał
tkankowy przechowywano w stanie zamrożenia w ciekłym azocie. W
celu oceny ploidii DNA w popłuczynach i tkankach po zamrożeniu oraz
mechanicznym rozdrobnieniu materiału tkankowego, uzyskany mate-
riał komórkowy utrwalano 70% alkoholem. Materiał poddawano trawie-
niu i barwieniu wg opisanej już wcześniej metody [6, 7]. Zawartość DNA
jądrowego była oceniana w cytofluorymetrze przepływowym FACStar
Plus (Becton Dickinson, Mountain View CA) z laserem argonowwym
(488 nm). Rejestrowano sygnał z minimum 10 000 jąder komórkowych.
Uzyskane sygnały przetwarzano, stosując program analizujący DNA
(DNA Cell Cycle Analysis Software-Ver. 5/87- Becton Dickinson). Okre-
ślano dystrybucję populacji komórkowej w obrębie poszczególnych faz
cyklu komórkowego: G0-G1 S, G2/M oraz względną zawartość DNA w
badanych komórkach. Wyliczano współczynnik proliferacji, czyli pro-
cent komórek znajdujących się w fazie S + G2/M cyklu komórkowego
oraz indeks DNA (I.D.), czyli zawartość DNA w komórkach badanych w
odniesieniu do komórek prawidłowych, przyjmując zawartość DNA w
komórce diploidalne) za 1. Jako kontroli wewnętrznej używano prawi-
dłowych komórek znajdujących się w każdym badanym preparacie, a
jako kontroli zewnętrznej używano ludzkich limfocytów T. Histogramy
klasyfikowano jako diploidalne lub aneuploidalne.
Z pozostałej części materiału sporządzane były skrawki mrożone, słu-
żące do oznaczeń immunohistochemicznych ekspresji białka p53. Bada-
nia immunohistocherniczne przeprowadzano korzystając z metody pe-
roksydazowej. Według ustalonego protokołu reakcji histochemicznej
skrawki poddawano reakcji z przeciwciałem monoklonalnym p53goat (fir-
my Santa Cruz Biotechnology, Inc). Za pozytywną reakcję przyjmowano
obecność powyżej 1 % zabarwionych komórek w porównaniu z pozosta-
łymi komórkami nowotworowymi. Kontrolę ujemną stanowiła zdrowa
tkanka nabłonka przejściowokomórkowego, a za kontrolę dodatnią przy-
jęto komórki nowotworu sutka linii MCF 7. Oznaczeń cytofluorymetrycz-
nych oraz interpretacje wyników ekspresji białka p53 przeprowadzano
we współpracy z dr hab. Danutą Duś z Zakładu Immunologii Nowotwo-
rów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu.
Ze względu na małą liczbę pacjentów, jak i różne metody terapeutycz-
ne, które zastosowano (elektroresekcja, cystektomia, chemioterapia i inne)
nie wykonano badań statystycznych oraz nie oceniano czasu przeżycia.
WYNIKI
W badanych tkankach uzyskano ekspresję białka p53 u 15 z 32 chorych
(46,8%). Dotyczyło to 6 z 20 pacjentów z guzami powierzchownymi (30%)
oraz 9 z 12 osób z guzami inwazyjnymi (75%). Różnica w ekspresji białka
p53 zaznaczyła się wyraźnie między guzami powierzchownymi a nacie-
kającymi, natomiast nie było dużej różnicy między występowaniem p53(+)
a poszczególnymi stopniami T2,T3 i T4. Wyraźnie zaznaczyła się tendencja
do częstszej obecności białka p53 w miarę wzrostu stopnia zaawansowa-
nia nowotworu-, pomimo dość małej liczebności pacjentów w poszczegól-
nych podgrupach. Ekspresję białka p53 stwierdzono w 27% guzów o stop-
niu złośliwości G1 (3 z 11), w 44% w guzach o stopniu złośliwości G2 (4 z 9)
oraz w 72% w guzach G3 (8 z 11). Obecność białka p53 w zależności od
stopnia zaawansowania i zróżnicowania prezentuje tabela II.
W grupie guzów powierzchownych ekspresja białka p53 wystąpiła u
wszystkich 5 z 7 pacjentów z progresją choroby, a wznowę obserwowa-
no niemal równie często u pacjentów bez ekspresji białka p53 (u połowy
pacjentów: 6 z 12), jak i z ekspresją białka (u 62% pacjentów: 5 z 8). Nato-
miast czas wolny od wznowy był zdecydowanie dłuższy u pacjentów
bez ekspresji białka p53 (27,2 v 17 miesięcy).
Aneuploidia pojawiała się częściej wraz ze wzrostem stopnia złośli-
wości i częściej dotyczyła guzów naciekających. Stwierdzono duży zwią-
zek między występowaniem aneuploidii a ekspresją białka p53. Ponad
połowa guzów z ekspresją białka p53 (11 z 20) wykazywała nieprawi-
dłowy, aneuploidamy profil DNA, natomiast tylko u 4 z 12 guzów di-
ploidalnych zaobserwowano ekspresję p53 (tabela II).
U części pacjentów zbadano również nabłonek urotelialny zdrowy, bez
zmian chorobowych widocznych w badaniu endoskopowym. W guzach
powierzchownych u wszystkich 7 osób, u których wykonano badanie,
nabłonek ten wolny był od ekspresji białka p53, natomiast w guzach na-
ciekających u 5 osób z 9 badanych widoczna była ekspresja p53.
OMÓWIENIE
W prezentowanych badaniach wstępnie podjęto próbę oceny ekspre-
sji białka p53, jako czynnika prognostycznego u pacjentów z rakami przej-
ściowokomórkowy mi pęcherza moczowego. W badanych tkankach uzy-
skano ekspresję tego białka u około 46% chorych, u 30% z guzami
powierzchownymi i ponad 70% z guzami inwazyjnymi. Tak wysoki pro-
cent obecności białka p53 w prezentowanej serii pokrywa się z niektóry-
mi doniesieniami innych autorów, gdzie stwierdzany odsetek guzów z
kumulacją p53 sięga od 29 do 61% przypadków (tabela III).
Różnice w uzyskanych wynikach są prawdopodobnie spowodowane
wieloma czynnikami, jak np. różnicami w doborze pacjentów, brakiem
standaryzacji technik laboratoryjnych, a także różnicami w interpretacji
uzyskanych obrazów immunohistochemicznych. Zgodnie z większością
autorów, w guzach powierzchownych kumulacja białka p53 jest mniej-
sza [8,14], a zdecydowanie wzrasta w guzach inwazyjnych [3, 5,14,15].
Ozdemir i wsp. udowodnili, badając tkanki guzów pęcherza, że istnieje
silna korelacja między pojawieniem się produktów degradacji błony pod-
stawnej, co jest bezpośrednim wskaźnikiem inwazji guza, a ekspresją
białka p53 [13]. W naszych badaniach różnica w ekspresji białka p53 za-
znaczyła się wyraźnie między guzami powierzchownymi a naciekający-
mi, natomiast nie było różnicy między występowaniem p53(+) a poszcze-
gólnymi stopniami T2, T3 i T , co być może związane jest z małą
liczebnością poszczególnych podgrup.
Większość autorów [3, 5, 8, 14, 15, 20] opisuje wzrastającą tendencję
pojawiania się ekpresji białka p53 w miarę wzrostu stopnia złośliwości
guza co znalazło odbicie również w naszych badaniach, gdzie w guzach
o stopniu złośliwości G1 kumulację p53 rejestrowano w 27% przypad-
ków, a w G2i G3 odpowiednio w 44% i 75% przypadków. W nielicznych
pracach nie stwierdzono korelacji między stopniem zaawansowania kli-
nicznego a kumulacją białka p53 i wydaje się, iż różnice mogą pojawiać
się w zależności, jaką wartość odsetka zabarwionych jąder przyjmiemy
za wartość graniczną 5,10 czy 20%. Według Casetty i wsp. [1] w guzach
powierzchownych wartość prognostyczną ma nawet śladowa ilość barw-
nika świadcząca o ekspresji p53 (> 0%). Autorzy ci porównali wartość
prognostyczną ekspresji białka p53 przy wartościach odcinających > 0%
i > 5% ale tylko pierwsza wartość miała znaczenie prognostyczne.
Zauważyliśmy w naszej pracy ścisły związek między aneuploidią a eks-
presją p53. Ponad połowa guzów z ekspresją białka p53 (11 z 20) wykazy-
wała nieprawidłowy, aneuploidalny profil DNA, natomiast tylko u 4 z 12
guzów diploidalnych zaobserwowano ekspresję p53. Zgodne jest to z nie-
licznymi doniesieniami, jakie się pojawiły na ten temat [5,15].
Z wielu przeprowadzonych badań wynika, że białko p53, zarówno
jako samodzielny wskaźnik molekularny lub łącznie z innymi powinien
być znaczącym prarametrem w ocenie ryzyka nawrotów i progresji [4,5,
12]. W naszym badaniu w grupie guzów powierzchownych ekspresja
białka p53 wystąpiła u 5 z 7 pacjentów z progresją choroby, a wznowę
obserwowano niemal równie często u pacjentów bez ekspresji białka p53 – u połowy pacjentów (6 z 12), jak i z ekspresją białka, u 62% pacjentów
(5 z 8). Czas wolny od wznowy był zdecydowanie dłuższy u pacjentów
bez ekspresji białka p53 (27,2 v. 17 miesięcy).
Przedstawione wstępnewyniki wymagajądalszychprac prowadzonych
na obszerniejszym materiale badawczym.
WNIOSKI
Ekspresja białka p53 i ploidia DNA oznaczana w popłuczynach i tkan-
kach jest użytecznym uzupełnieniem klinicznej i histologicznej oceny
guzów pęcherza moczowego. Pojawienie się ekspresji białka p53 i aneu-
ploidii DNA może wskazywać na wysokie ryzyko wczesnej wznowy i
progresji choroby.

1. [1] Casetta, G., Gontero, R, Russo, R., Tizzani, A.: p53 ekspression compared
2. with other prognostic factors in OMS grade-I, stage Tg transitional cell carcinoma of
3. the bladder. Eur. Urol. 1997,32,229-236.
4. [2] Dowell, S. R, Wilson, R O., Derias, N. W., et al.: Clinical utylity ofthe
5. immunocytochemical detection ofthe p53 protein in cytological specimens. Cancer
6. Res. 1994, 54, 2914-2918.
7. [3] Glick, S. H., Howell, L. R, Devere-White, R. W.: Relationship ofp53 and
8. bcl-2 to prognosis in muscle-invasive transitional cell carcinoma of the bladder. J.
9. Urol. 1996,155,1754-1757.
10. [4] Herr, H. H., Bajorin, D. D., Scher, H. I., Cordon-Cardo, C, Reuter, V.:
11. Can p53 help select patients with invasive bladder cancer for bladder preseruation?
12. J. Urol., 1999,161, 20-23.
13. [5] Jahnson, S., Risberg, B., Kerlsson, M. G.: p53 and Rb immunostaining in
14. locally advanced bladder cancer. Eur. Urol. 1995, 28,135-142.
15. [6] Kołodziej, A., Duś, D., Lorenz, J.: Ploidia DNA a czas przeżycia pacjentów z
16. guzami pęcherza moczowego; badania retrospektywne. Urol. Pol. 1997,1,19.
17. [7] Kołodziej,.. A., Duś, D., Lorenz, J.: Wartość prognostyczna ploidii DNA w
18. rakach pęcherza moczowego. Urol. Pol. 1996,4,12.
19. [8] Lipponen, P. K.: Over-expression ofp53 nuclear oncoprotein in transitional cell
20. bladder cancer and its prognostic value. Int. J. Cancer 1993, 53,1393-1398.
21. [9] Lowe, S., Ruley, H.: p53 dependent apopoptosis modulates the cytotoxidty of
22. anticancer agents. Cell 1993, 74, 957-967.
23. [10] Moch, H., Sauter, G., Mitatsh, M. J. et al.: p53 but not erbB-2 expression is
24. associated with rapid tumour proliferation in urinary bladder cancer. Hum. Pa-
25. thol. 1994, 25,1346-1351.
26. [11] Morkve, O., Laerum, O. D.: Flow cytometric measurement of p53 expression
27. and DNA content in bronchial carcinomas. Cytometry 1981,12, 438-444.
28. [12] Ovesen, H., Horn, T., Steven, K.: Long-term efficacy of intravesical BCG for
29. carcinoma in situ; relationship of progression to histopathological responce and p53
30. accumulation. J. Urol. 1997,157,1655-1659.
31. [13] Ozdemir, E., Kakehi, Y., Okuno, H., Yoshida, O.: Strong correlation of
32. basement membrane degradation with p53 inactwation and/or MDM2 overexpres-
33. sion in superficial urothelial carcinomas. J. Urol. 1997,158, 206-211.
34. [14] Pfister, Ch., Buzelin, F., Casse, Ch. et al.: Comparative analysis of MiBl
35. and p53 expression in human bladder tumors and their correlation with progression.
36. Eur. Urol. 1998, 33, 278-284.
37. [15] Raitanen, M. R, Tammela, T. L., Kallioinen, M., Isola, J.:p53 accumula-
38. tion, DNA ploidy and progression of bladder cancer. J. Urol. 1997,157,1250-1253.
39. [16] Scott, N., Sagar, P., Steward, J. et al.: p53 in colorectal cancer. Br. J. Cancer
40. 1991, 61, 369.
41. [17] Sherman, C. D.: Onkologia kliniczna. PZWL, Warszawa 1992.
42. [18] Skinner, D. G., Lieskovski, G.: Management of invasive and high grade blad-
43. der cancer. In: Diagnosis and management of genitourinary cancer. D. G. Skinner
44. and D. G., Lieskovski (eds.),.Philadelphia 1996. W. B. Saunders Co., 295-312.
45. [19] U. I. CC: TNM classification of malignant tumours. Geneva 1998.
46. [20] Ye, D., Zheng, J., Qian, S., Ma, Y.: Expression of p53 product in chinese hu-
47. man bladder human carcinoma. Urol. Res. 1993, 21, 223-226.
48. [21] Zatoński, W.: Nowotwory złośliwe w Polsce w 1989 roku. ZOWzRiEN, War-
49. szawa 1992.