PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Calcitriol ogranicza proliferację komórek raka prostaty poprzez wpływ na metabolizm prostaglandyn
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2006/59/1.

autorzy

Michael Fischereder, Karl-Walter Jauch
Cancer Research 2005; 65: 17 . September 1

streszczenie

Celem prezentowanej pracy jest wyjaśnienie mechanizmów leżących u podłoża przeciwnowotworowego działania calcitriolu. Ponieważ prostaglandyny (PG) są jedną z grup mediatorów stymulujących proliferację komórek, w tym raka prostaty, badacze analizowali wpływ calcitriolu na ich metabolizm. Badania prowadzono na hodowanych in vitro liniach komórek raka prostaty LNCaP (androgenozależnej), PC-3 (androgenoniezależnej) i linii pierwotnej, uzyskanej z prawidłowego i zmienionego nowotworowo nabłonka prostaty. Uzyskane wyniki wykazują, że calcitriol hamuje aktywność cyclooxygenazy-2, nasila aktywność dehydrogenazy prostaglandynowej ? ważnych enzymów metabolizmu prostaglandyn ? a także zmniejsza syntezę mRNA dla receptorów prostaglandynowych EP2 i FP.
Dodatkowo wykazano synergistyczne działanie calcitriolu i niesterydowych leków przeciwzapalnych w ograniczaniu proliferacji linii komórek raka gruczołu krokowego.

Wprowadzenie
Zasadniczą metodą leczenia zaawansowanego raka gruczołu krokowego pozostaje blokada androgenowa. W początkowym okresie leczenia u większości pacjentów uzyskiwana jest dobra odpowiedź na zastosowaną terapię. Jednak w miarę upływu czasu dochodzi do rozwoju hormonooporności. Nowotwór ?wymyka się? spod kontroli i u większości pacjentów dochodzi do rozwoju odległych przerzutów. Dlatego też prowadzone są badania nad opracowaniem innych sposobów zahamowania proliferacji komórek raka prostaty.
Wykazano, że calcitriol (aktywna pochodna 1,25 (OH) 2 witaminy D), prócz powszechnie znanego wpływu na gospodarkę fosforowo-wapniową, pobudza różnicowanie i hamuje proliferację wielu typów komórek (prawidłowych i nowotworowych). Działanie to wykazano także wobec komórek raka prostaty. U podstaw tego zjawiska leży wpływ calcitriolu na przebieg cyklu komórkowego, indukcję apoptozy za pośrednictwem różnych genów (m. in. bcl-2, p21) i czynników wzrostu.
Wśród szeregu genów ?wrażliwych? na D3 odkryto dwa kodujące enzymy kluczowe dla metabolizmu prostaglandyn. Są to cyclooxygenaza-2 (COX-2), będąca najważniejszym enzymem syntezy PG, i dehydrogenaza 15-hydroksyprostaglandynowa (15-PGDH), rozkładająca prostaglandyny do ich ketopochodnych.
Gen COX-2 zaliczany do onkogenów jest pobudzany przez szereg czynników wzrostowych, cytokin i substancji o działaniu zapalnym, a jego wzmożoną aktywność stwierdzamy w szeregu nowotworów, m. in. w przypadku raka prostaty. Leki blokujące enzym COX-2 hamują ich wzrost komórek in vitro i in vivo. Nowotwory, których komórki cechują się wysoką aktywnością COX-2, są oporne na apoptozę, blokują przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną i mają wysoki potencjał angiogenny. Jednocześnie stwierdzono w nich spadek aktywności enzymu 15-PGDH, unieczynniającego prostaglandyny poprzez oksydację grup 15-hydroksylowych. Jego aktywność jest regulowana przez szereg hormonów. Wykazano wzrost aktywności enzymu w komórkach LNCaP pod wpływem androgenów. Czynność jego ulega obniżeniu przy szeregu nowotworach, np. raku jelita grubego, płuc, prostaty, sutka. Gen kodujący 15-PGDH zaliczamy do genów supresji nowotworów, a przeniesienie go za pomocą wektora do komórek nowotworowych powoduje spadek proliferacji, hamowanie formowania guza i blokowanie angiogenezy.
Prostaglandyny pełnią wiele funkcji, biorą udział w reakcjach zapalnych, hemostazie, regulują czynność naczyń. Wykazano ich czynny udział w rozwoju nowotworów, m. in. raka prostaty. Także komórki tego guza same produkują i wydzielają do środowiska prostaglandyny. Przez receptory prostaglandynowe typu EP2 i FP pobudzają własną proliferację, m. in. indukując czynność genów wczesnej odpowiedzi (np. c-fos).
Doświadczalnie stwierdzono, że w komórkach nowotworowych poddanych działaniu wit. D3 dochodzi do:
1. Spadku ekspresji CoX-2, receptorów prostaglandynowych EP2 i FP.
2. Wzrostu aktywności 15-PGDH.
3. Spadku wydzielania do środowiska prostaglandyn PGE2.

Cel pracy
Celem prezentowanej pracy jest ocena wpływu calcitriolu na enzymy COX-2, 15-PGDH i produkcję prostaglandyn w komórkach raka prostaty linii androgenozależnej (LNCaP), hormonoopornej (PC3) i liniach pierwotnych prawidłowego i nowotworowego nabłonka gruczołu krokowego. Dodatkowo oceniono synergizm działania calcitriolu i niesterydowych leków przeciwzapalnych na wyżej wymienione parametry.

Materiał i metoda
Badania prowadzono in vitro na liniach komórek raka prostaty ? androgenozależnej (LNCaP) i hormonoopornej (PC3) i liniach pierwotnych prawidłowego i nowotworowego nabłonka gruczołu krokowego, wyprowadzonych z materiału uzyskanego po prostatektomii radykalnej.
Intensywność proliferacji komórek oceniano na podstawie całkowitej zawartości DNA. Ekspresję badanych genów oceniano na podstawie zawartości odpowiedniego mRNA i za pomocą metody PCR. Oceniano także stężenie prostaglandyny PgE2 w medium hodowlanym każdej linii. Ekspresję białek (enzymów) COX-2 i 15-PGDH oceniano metodą blottingu według Westerna.

Wyniki
1. Uzyskano znaczący spadek poziomu mRNA COX-2 w liniach komórkowych poddanych działaniu witaminy D3 (w linii LNCaP o 70%, PC-3 o 45%, w linii pierwotnej prawidłowego nabłonka prostaty o 55-90% i w linii pierwotnej raka prostaty 48-60%). Nie wykazano spadku ekspresji mRNA COX-2 w miarę wzrostu stężenia calcitriolu w medium hodowlanym (z 10 nmol/L do 100 nmol/L)
2. Calcitriol zwiększa ekspresję genu 15-PGDH mierzoną poziomem mRNA (3,6x dla linii LNCaP, 3x dla PC-3, 2-18x dla linii pierwotnej prawidłowego nabłonka prostaty i 2-4x dla linii pierwotnej raka prostaty) i stężeniem białka enzymu. Zjawisko to jest zależne od stężenia witaminy D3.
3. Autorzy wykazali 34% spadek stężenia prostaglandyny PGE2 w medium hodowlanym linii LNCaP, poddanej działaniu calcitriolu. Efekt ten jest zależny od zastosowanego stężenia witaminy D3.
4. W komórkach linii hormonoopornej (PC-3) calcitriol (stęż. 10 nmol/L) całkowicie znosi indukcję aktywności c-fos wywołaną ednogennie syntetyzowanymi prostaglandynami.
5. Wykazano, że w badanych liniach komórek raka prostaty (LNCaP i PC-3) pod wpływem calcitriolu dochodzi do ograniczenia proliferacji (mierzonej całkowitą zawartością DNA komórek) wywołanej prostaglandynami (PGE2, PGF2) pochodzenia endo- i egzogennego.
6. Prócz ograniczania syntezy prostaglandyn calcitriol hamuje ich wpływ na komórki, blokując syntezę białek receptorów prostaglandynowych EP2 i FP.
7. Wykazano synergizm działania calcitriolu i niesterydowych leków przeciwzapalnych (NSAID) w odniesieniu do ocenianych parametrów aktywności COX-2, 15-PGDH, syntezy prostaglandyn i proliferacji linii komórek raka gruczołu krokowego. Łączne stosowanie tych leków pozwala na uzyskanie efektu przy zastosowaniu stężenia 2-4x mniejszego niż w przypadku zastosowania każdego z tych leków osobno.

Wnioski
1. Regulacja metabolizmu prostaglandyn jest dodatkowym, nowym mechanizmem antyproliferacyjnego działania calcitriolu.
2. Efekt ten jest osiągany przez ograniczenie ekspresji enzymu COX-2, wzrost ekspresji enzymu 15-PGDH i spadek ekspresji receptorów prostaglandynowych EP2 i FP.
3. Ponieważ prostaglandyny pochodzenia endo- i egzogennego stymulują proliferację komórek raka prostaty i hamują ich apoptozę, to opisane powyżej właściwości calcitriolu mogą zostać wykorzystane w terapii hormonalnej raka gruczołu krokowego.
4. Niesterydowe leki przeciwzapalne i calcitriol wykazują synergizm działania, co pozwala na zwiększenie oczekiwanego efektu terapeutycznego.
5. Calcitriol może pełnić istotną rolę w chemoprewencji raka prostaty.

Komentarz
Możliwy wpływ aktywnych postaci witaminy D na procesy nowotworzenia. Zarys danych epidemiologicznych i doświadczalnych

Calcitriol to hormon powstający w wyniku przemian prohormonu ? witaminy D, występującej w pokarmach zwierzęcych jako cholekalcyferol lub w roślinnych jako ergokalcyferol. Jednak większość wykorzystywanej w dalszych procesach prowitaminy D (około 90% puli osoczowej) powstaje w skórze pod wpływem promieniowania ultrafioletowego z 7-dehydrocholesterolu. Po szeregu przemianach, polegających na hydroksylacji witaminy D w wątrobie do postaci 25 (OH) i nerkach do 1,25 (OH) 2, powstaje jej najbardziej aktywny metabolit ? calcitriol. Tradycyjnie miejsce działania 1,25 (OH) 2D3 lokalizowano w komórkach nabłonka jelit, kanalików nerkowych i osteoblastach. Obecnie wiadomo, że hormon ten wykazuje aktywność w stosunku do wielu innych komórek, jak np. komórek szpiku, wysp trzustki, grasicy, nabłonka jąder, prostaty, sutka, łożyska, szereg komórek nowotworowych. Aktywność enzymów przemian witaminy D stwierdzamy w innych komórkach i tkankach, m. in. w komórkach raka prostaty. Calcitriol oddziałuje na komórkę za pośrednictwem receptora VDR, należącego do grupy receptorów sterydowych, zlokalizowanych w cytoplazmie. Obecność VDR wykazano w komórkach nabłonka jelit, wątrobie, kościach, komórkach układu odpornościowego, hemoatopoezy, skóry, trzustki, mózgu, wielu gruczołów (m. in. w raku prostaty), kości, chrząstki. Kompleks receptor+1,25 (OH) D3 wiąże się z odpowiednimi odcinkami chromosomów, prowadząc do pobudzenia docelowych genów, czego skutkiem jest ich transkrypcja, powstawanie mRNA i dalej synteza białek efektorowych (np. białek wiążących wapń w nabłonku jelit).
Pod wpływem nowych informacji, potwierdzających, że calcitriol pobudza różnicowanie komórek, hamuje proliferację, pobudza apoptozę i działa immunosporesyjnie wielu badaczy zasugerowało stosowanie witaminy D3 w chorobach, u podłoża których leży niekontrolowany rozrost komórek. Przykładem może być łuszczyca, chłoniaki lub nowotwory.
Działanie przeciwnowotworowe witaminy D łączone jest z jej szerokim spektrum działania ? od zwalniania przebiegu cyklu komórkowego (m. in. dzięki stymulacji p21) poprzez indukcję aptozy (m. in. obniżenie ekspresji białek antyapoptotycznych jak Bcl-2) do blokowania wpływu czynników wzrostowych na komórkę (EGF, KGF, IGF, bFGF, PTH-related peptide itp.) lub indukcji syntezy czynników antywzrostowych (TGF-beta) czy hamowania aktywności telomerazy. Przyczynia się to do spadku proliferacji komórek nowotworowych, wzrostu zróżnicowania (m. in. poprzez wzrost ekspresji receptora androgenowego), zmniejszenia zdolności do tworzenia przerzutów (m. in. stymulacji cadheryn). Dodatkowym efektem przeciwnowotworowym jest wpływ na hamowanie angiogenezy.
Na prawdopodobieństwo związku witaminy D z częstością występowania nowotworów u ludzi zwrócono uwagę już w latach trzydziestych. Wykazano znacznie rzadsze występowanie szeregu guzów u osób poddanych wieloletniej ekspozycji na promienie słoneczne. Z drugiej strony w tej grupie osób znacznie częściej występuje rak podstawnokomórkowy, ale mający łagodniejszy przebieg od innych guzów. Zjawisko to starano się tłumaczyć stymulacją immunologicznej odpowiedzi przeciwnowotworowej przez tę postać nowotworu skóry.
Pod koniec lat osiemdziesiątych w Kalifornii, epidemiolodzy stwierdzili znacznie mniejsze ryzyko wystąpienia raka jelita grubego i raka sutka, pęcherza moczowego, jajnika, chłoniaków, trzustki, żołądka, macicy i wielu innych, u osób często przebywających na otwartym słońcu. W przypadku raka sutka redukcja ryzyka wyniosła 50% (r= -0,80, p=0,0001). Podobną zależność stwierdzono w przypadku raka prostaty. Dane epidemiologiczne z Południowej Karoliny wykazują znamiennie niższą częstość występowania nieprawidłowych poziomów PSA u osób poddanych intensywnej ekspozycji na promieniowanie słoneczne. W Anglii natomiast stwierdzono trzykrotny wzrost ryzyka nieprawidłowego poziomu PSA u osób z niską ekspozycją na słońce, a także trzykrotnie większe ryzyko wystąpienia raka prostaty w tej grupie.
Z kolei dalsze badania laboratoryjne ujawniły wpływ aktywnych postaci witaminy D na funkcjonowanie komórek. Stwierdzono, że osoby, które zapadły na wyżej wymieniane guzy, miały niski poziom witaminy D w osoczu. Ustalenie, jaki poziom witaminy D w osoczu można uznać za odpowiedni, w obecnej sytuacji jest trudne. Dotychczasowy uznany za minimalny wynoszący 15 ng/ml określono na podstawie ryzyka wystąpienia zmian kostnych, ale ? jak się podkreśla ? nie wiemy obecnie, jaki jest minimalny poziom wymagany do utrzymania prawidłowego stanu innych tkanek (w tym m. in. prostaty). Badania epidemiologiczne i statystyczne, porównujące poziom witaminy D w osoczu w populacjach osób zamieszkujących mało nasłonecznione wyższe szerokości geograficzne (Skandynawia i Wielka Brytania) i wysoko nasłonecznione południowe stany USA, wskazują, że np. w Finlandii 50% mężczyzn ma poziom witaminy D poniżej 16 ng/ml, a na Hawajach u żadnego z badanych nie stwierdzono poziomu poniżej 21 ng/ml. W innych stanach południowych USA odsetek osób z niedoborem wynosił od 5% do 13%. Podobnie, ryzyko zachorowania na raka prostaty mężczyzn w Finlandii jest od trzech do czterech razy wyższe.
Rak gruczołu krokowego jest najczęstszym nowotworem u mężczyzn, wpływającym w istotny sposób nie tylko na śmiertelność, ale i na jakość życia. Dane epidemiologiczne wskazują, że zachorowalność i śmiertelność na raka prostaty może być odwrotnie proporcjonalna do intensywności ekspozycji na światło słoneczne lub dostępności promieni UV dla głębszych warstw skóry. Według części autorów mogłoby to tłumaczyć wyższą częstość tego nowotworu wśród mieszkańców Europy Północnej i przedstawicieli rasy czarnej. Z kolei badania genetyczne pacjentów z rodzin o wysokiej częstości występowania PC ujawniły zmiany w szeregu genów, w tym polimorfizm genu receptora witaminy D (VDR gene). Dalsze badania wykazały, że receptor dla witaminy D jest obecny nie tylko w prawidłowych czy też nowotworowo zmienionych komórkach nabłonka prostaty, ale i w komórkach zrębu gruczołu, i że calcitriol za pośrednictwem VDR istotnie wpływa na czynność prostaty (prawidłowej, w stanie łagodnego rozrostu i w przypadku raka).
Badania komórek raka prostaty prowadzone in vitro zmniejszyły nadzieje na wykorzystanie antyproliferacyjnych właściwości witaminy D3 w terapii. Okazało się, że calcitriol działa silnie antyproliferacyjnie w stosunku do linii hormonozależnej LNCaP, natomiast bardzo słabo w przypadku linii hormonoopornej DU145. W dalszych etapach ujawniono interesujące wytłumaczenie tego zjawiska. Otóż po zablokowaniu za pomocą leków enzymów biorących udział w inaktywacji witaminy D3, uzyskano efekt antyproliferacyjny jak w przypadku komórek LNCaP. Podobne zjawisko wystąpiło po zadziałaniu na DU 145 bardzo wysokich stężeń calcitriolu. Zjawiska te można wytłumaczyć istnieniem alternatywnych dróg działania witaminy D3 lub/i różnorodnością procesów prowadzących w efekcie do zmian nowotworowych komórek prostaty.
Mimo optymistycznego wydźwięku omawianego artykułu, pozwolę sobie na parę uwag. Przedstawione wyżej obserwacje wyglądają bardzo zachęcająco, jednak ? jak w wielu innych przypadkach ? i w tej beczce miodu jest łyżka dziegciu.
1. Przewlekłe stosowanie wysokich dawek witaminy D ? czego wymagałaby chemoprewencja raka prostaty z jej użyciem ? prowadzi do hyperkalciurii, hiperkalcemii z wszelkimi konsekwencjami, a także (według pewnych danych) może nasilać rozwój miażdżycy naczyń (w laboratoriach dąży się do syntezy analogów calcitriolu pozbawionych wpływu na gospodarkę wapniową ? do chwili obecnej opracowano około 2000 tego typu związków).
2. W literaturze cytowane są wyniki badań, niepotwierdzających przytaczanych wyżej informacji.
3. Rozwój nowotworów nie zależy od zadziałania pojedynczego czynnika czy zmiany jednego szlaku metabolicznego.
4. Cytowane badania kliniczne drugiej fazy, dotyczące użycia witaminy D w zaawansowanym hormonoopornym raku prostaty, nie wykazały odpowiedzi klinicznej u pacjentów (co nie mówi o wpływie przewlekłego profilaktycznego przyjmowania witaminy D na ryzyko zachorowania). Z kolei w grupie pacjentów po leczeniu radykalnym (poddanych prostatektomii lub radioterapii), u których stwierdzono wzrost PSA (ale brak przerzutów), po zastosowaniu wysokich dawek D3 zaobserwowano statystycznie znamienny wolniejszy wzrost PSA w porównaniu z grupą kontrolną.

Piśmiennictwo dotyczące omawianego tematu dostępne u autora.

adres autorów

dr n. med. Stanisław Wroński
Oddział Urologii Szpitala Wojewódzkiego im. dr. J. Biziela
ul. Ujejskiego 75
85-168 Bydgoszcz
wrona@ozzl.org.pl