PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Znaczenie immunohistochemicznej oceny aktywności proliferacyjnej w raku prostaty
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2001/54/2.

autorzy

Zdzisław Skok, Mieczysław Gajda
Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej AM w Bydgoszczy Kierownik: prof. zw. dr hab. med. Jan Domaniewski

słowa kluczowe

stercz, rak, markery proliferacyjne, indeks proliferacji PCNA, Ki-67

streszczenie

Cel pracy: Leczenie raka prostaty metodą radykalnej prostatektomii, mimo bogatych doświadczeń operacyjnych, jest ciągle dyskutowane. Tylko wnikliwa ocena pozwala zakwalifikować chorego do radykalnego zabiegu lub innej formy leczenia. Konwencjonalne histopatologiczne kryteria złośliwości są uzupełniane przez immunohistoche-miczne oznaczanie markerów proliferacyjnych. Celem pracy było wykazanie istnienia korelacji między ekspresją PCNA i Ki-67 a klinicznym stopniem zaawansowania T i histopatologicznym stopniem złośliwości wg klasyfikacji Gleasona.
Material i metody: 35 gruczołów krokowych po radykalnej prostatektomii utrwalano w zbuforowanej 10%
formalinie. Skrawki tkankowe, grubości 5 mikrometrów, uprzednio zatapiane w parafinie, barwiono rutynowo metodą H+E. Histopatologicznej oceny guzów dokonano zgodnie z kryteriami WHO oraz według 10-stopniowej klasyfikacji Gleasona. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono stosując przeciwciała monoklonalne PCNA i MIB-1 firmy Novocastra. Oceny ekspresji badanych antygenów dokonano metodą pólilościową, określającą intensywność zabarwienia jąder komórkowych w nie mniej niż 600 komórkach. Dla każdego guza obliczono wskaźnik proliferacji (IP) będący odsetkiem komórek wykazujących ekspresję PCNA i MIB-1, do ogólnej liczby ocenianych komórek. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą testu Kruskala-Wallisa.
Wyniki: Analiza statystyczna wykazała, że średnie wartości PCNA i MIB-1 dla trzech stopni zaawansowania nowotworu i trzech grup stopnia złośliwości histologicznej różnią się istotnie (p < 0,001) (wartość statystyki testowej była równa dla PCNA - x2 = 33,57 i dla MIB-1 - x2 = 59,71). W naszych badaniach stwierdziliśmy ekspresję antygenu PCNA we wszystkich analizowanych przypadkach i była ona większa (średni IP=38,2%) od ekspresji antygenu MIB-1 (średni IP=14,3%). co jest związane z występowaniem PCNA w czasie całego cyklu komórkowego. Średni indeks proliferacyjny PCNA i MIB-1 istotnie rośnie (p < 0,001) wraz ze wzrostem stopnia złośliwości histologicznej wg klasyfikacji Gleasona.
Wnioski:
1. Ekspresja PCNA i MIB-1 koreluje znamiennie ze stopniem histologicznego zróżnicowania wg klasyfikacji Gleasona i jednocześnie zwiastuje złe rokowanie. Korelacje (e umożliwiają dokładne określenie złośliwości i inwazyjności raka w materiale biopsyjnym.
2. Nie stwierdzono bezpośredniego związku między stopniem przedoperacyjnego (klinicznego) zaawansowania guza a ekspresją antygenów PCNA i MIB-1.
3. Analiza kinetyki proliferacyjnej w raku prostaty pozwala nie tylko na dokładne określenie jego potencjału pro-liferacyjnego, ale również na bardziej precyzyjne oszacowanie biologicznej złośliwości oraz zastosowanie racjonalnej terapii, co daje lepsze rokowania.
( . . . )polimeraz delta o ciężarze 36 kD., dające się oznaczyć we wszystkich fazach cyklu komórkowego [4, 5, 6, 7]. Sprawia to, że PCNA jest pożytecznym markerem proliferacji komórkowej. Przeciwciało monoklonalne wybarwia selektywnie, a przez to indentyfikuje proliferujące fragmenty tkanki w preparacie histopatologicznym. Wyizolowano w sumie 11 różnych przeciwciał monokionalnych (PCI - PC11) skierowanych przeciw tej proteinie. W naszej pracy użyto przeciwciało monoklonalne PC 10. które wykazuje duże powinowactwo do PCNA oraz dodatkowo posiada oporność w stosunku do utrwalania w formalinie i zatapiania w parafinie [4, 8]. Przeciwciało monoklonalne Ki-67, po raz pierwszy opisane przez Gerdes i wsp., jest skierowane przeciw antygenowi jądrowemu, którego ekspresję można stwierdzić nie tylko w pro-liferujących komórkach, ale także w mitozie i interfazie. Ki-67 jest komponentą matrix komórkowego i reaguje z antygenem jądrowym. Wzrastającą ekspresję stwierdza się w fazach Gl, S, G2 i M cyklu komórkowego, jej brak w fazie GO. Maksymalną ekspresję stwierdza się w fazie G2/M [6, 7, 9]. Przeciwciało monoklonalne Ki-67 jest pożytecznym markerem proliferacji komórkowej, służącym do oznaczania czynników wzrostu nowotworów. Obecnie w komercjonalnym użyciu jest MIB-1, będący epitopem Ki-67 i możliwy do użycia także w skrawkach pochodzących z bloczków parafinowych [10]. Diagnostyczne i prognostyczne znaczenie Ki-67 jako markera proliferacji jesl powszechnie uznane i wykazane w wielu różnych publikacjach [6, 7]. CEL PRACY Celem pracy jest wykazanie czy istnieje korelacja miedzy ekspresją PCNA i Ki-67 a klinicznym stopniem zaawanso- wania guza T i histopatologicznym zróżnicowaniem wg klasyfikacji Gleasona oraz czy markery te mogą być użyte jako markery proliferacyjne w rutynowej diagnostyce biopsyjnej z bloczków parafinowych. MATERIAŁ I METODY Badaniom poddano gmczory krokowe 35 pacjentów operowanych w Klinice Urologii AMB w okresie od stycznia 1995 do grudnia 1997. Średni wiek pacjentów wynosił 68 lat (61 -72 lata). Guzy klasyfikowano zgodnie z klasyfikacją TNM U ICC. Badane skrawki tkankowe pochodziły z preparatów operacyjnych po radykalnej proslatektomii nitynowo utrwalonych w zbuforowanej 10% formalinie i zatopionych następnie w parafinie. W pracy użyto skrawków grubości 5 mikronów, które najpierw barwiono metodą I IE. Histopatologicznej oceny guzów dokonano zgodnie z kryteriami WHO oraz według 10- stopniowej klasyfikacji [11]. Badania immunohisto-chemiczne przeprowadzono stosując przeciwciała monoklonalne PCNA i MIB-1 finny Nowocastra, w rozcieńczeniu 1:100, wg metody BSA (biolyna - streptawidyna) zgodnie z zalecaną instaikcją. Oceny ekspresji badanych antygenów dokonano metodą półilościową określającą intensywność zabarwienia jąder komórkowych w nie mniej niż 600 komórkach przy powiększeniu mikroskopowym 400x (HPF high power field), stosując mikrometr okularowy w celu wyeliminowania błędu polegającego na powtórnym liczeniu tych samych komórek. Metoda la jest powszechnie uznana jako obiektywna i powtarzalna [12, 13]. Dla każdego guza obliczono wskaźnik proliferacji (IP), będący odsetkiem komórek wykazujących ekspresję PCNA i MIB-1, do ogólnej liczby ocenianych komórek [12, 14J. Dokonano analizy matematycznej uzyskanych wyników stosując test Kruskala-Wallisa oraz x2- WYNIKI DYSKUSJA Różnie nasiloną ekspresję antygenu PCNA stwierdzono we wszystkich badanych przypadkach. Wskaźnik proliferacji wynosił od 2% do 78% (średnio 38,2%). Jądra komórek barwiły się homogennie lub w formie drobnych, czasem rozproszonych ziarenek. Intensywność barwienia była zróżnicowana nawet w obrębie tego samego skrawka. Oceniano jądra z cechami reakcji barwnej niezależnie od intensywności zabarwienia, co jest zgodne z metodami przedstawionymi przez innych autorów - Maeda i wsp. [13]. Ekspresję antygenu MIB-I stwierdzono także we wszystkich badanych przypadkach, a wskaźnik proliferacji wahał się od 1 % do 39% (średnio 14,3%). Jądra komórek barwiły się w sposób dyfuzyjno-ziamisly lub tworząc drobne ziarenka. Barwienie miało charakter nierównomierny i wówczas widoczne były pola o wyraźnie silniejszej i słabszej reakcji barwnej. Analiza statystyczna wykazała, że średnie wartości PCNA i MIB-1 dla trzech stopni zaawansowania nowotworu i trzech grup stopnia złośliwości histologicznej różnią się istotnie (p < 0,001) (wartość statystyki testowej była równa dla PCNA - x: = 33,57 i dla MIB-1 -X2 = 59,71). Ekspresję antygenu PCNA stwierdzono we wszystkich analizowanych przypadkach i była ona większa (średni IP = 38,2%) od ekspresji antygenu MIB-1 (średni IP = 14,3%). Średni indeks proliferacyjny PCNA i MIB-1 istotnie rósł (p<0,001) wraz ze wzrostem stopnia złośliwości histologicznej wg klasyfikacji Gleasona. Średnie wartości indeksu proliferacji (IP) PCNA i MIB-1 w zależności od stopnia zaawansowania klinicznego i stopnia złośliwości histologicznej wg klasyfikacji Gleasona gru-czolakoraków stercza przedstawiają ryc. I i 2. Prawidłowa przedooperacyjna ocena stopnia klinicznego zaawansowania guza stanowi obecnie jeden z najważniejszych problemów we współczesnej diagnostyce nowotworów w urologii. Tylko połowa raków stercza określanych w czasie badania per rectum jako ograniczone do prostaty znajduje potwierdzenie w badaniu histopatologicznym preparatów uzyskanych po radykalnej prostatektomii. Również udoskonalona diagnostyka przedoperacyjna. przede wszystkim oznaczenie stężenia PSA, Iransrektalne, ultrasonograficzne badanie stercza oraz celowana biopsja pod kontrolą USG nie zawsze umożliwiają precyzyjne rokowanie [15]. Celem diagnostyki jest możliwie wczesne wykrycie raka prostaty w stadium zaawansowania, umożliwiającym zastosowanie skutecznej terapii [16]. Grading i staging biopsyjny na ogół różni się od ostatecznego gra-dingu i stagingu określonego w materiale uzyskanym z radykalnej prostektomii, przy czym w 25% przypadków ocena w skali Gleasona z biopsji jest zaniżona, a w 5% przypadków zawyżona [2J. Obecnie dokładniejsze oznaczenie stopnia proliferacji guza można uzyskać stosując między innymi metody immunohistochemiczne z zastosowaniem markerów prolife-racyjnych, np. PCNA i K.i-67 (MIB-1). Tak jak przy innych nowotworach, również w raku prostaty stosując te metody można wyróżnić raki o wysokim i niskim odsetku dodatniej reakcji przeciw zastosowanym antygenom PCNA i Ki-67 [5. 14, 16. 17, 18], W naszych badaniach stwierdziliśmy ekspresję antygenu PCNA we wszystkich analizowanych przypadkach i była ona większa (średni IP - 38,2%) od ekspresji antygenu MIB-1 (średni IP - 14,3%), co jest związane z. występowaniem PCNA w czasie całego cyklu komórkowego [5, 9]. Średni indeks proliferacyjny PCNA i MIB-I istotnie rośnie (p < 0,05) wraz ze wzrostem stopnia złośliwości wg skali Gleasona. Nasze badania wykazały niewielki wzrost średnich wartości indeksu proliferacyjnego PCNA i M1B-1 w zależności od stopnia klinicznego zaawansowania guza. Średni IP PCNA w guzach T, wynosił 31,2%, T, - 35,7% i T, - 39,1% (p = 0,06). Analogicznie średni indeks proliferacyjny MIB-1 wynosił w przypadku guzów T, - 12,2%, T3 12,0% i T4- 14,4% (p = 0,05). Podobne wyniki uzyskali inni autorzy. Wyniki Nemolo wskazują na wzrost ekspresji antygenu PCNA wraz ze wzrostem stopnia różnicowania guza. W łagodnym rozroście prostaty (BPH) stwierdził on tylko 1.2% PCNA dodatnich komórek, podczas gdy w raku prostaty dobrze zróżnicowanym - 2,5% komórek rakowych wykazywało dodatnią reakcją. W rakach średnio zróżnicowanych było to 4,6% komórek rakowych, a w rakach żle zróżnicowanych aż 7.6%. Praca ta udowadnia dodatnią korelację między liczbą komórek rakowych PCNA-dodatnich a stopniem zróżnicowania raka [19]. Również prace innych autorów wykazują wzrost indeksu proliferacji oraz wzrost liczby komórek reagujących dodatnio z antygenem PCNA i MIB-I wraz ze wzro- stem złośliwości i stopnia zaawansowania guza. Ekstremalnie wysokie wartości uzyskuje się w rakach litych [15, 20, 21]. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdziliśmy, że ekspresja PCNA i MIB-1 koreluje znamiennie ze stopniem histologicznego zróżnicowania w skali Gleasona i jednocześnie zwiastuje złe rokowanie. Korelacje te umożliwiają dokładne określenie złośliwości i inwazyjności raka również w materiale biopsyjnym. Nie stwierdzono natomiast bezpośredniego związku między stopniem przedoperacyjnego (klinicznego) zaawansowania guza a ekspresją PCNA i MIB-1. Immunohistochemicz-nie wykazano tylko bardzo słabe, statystycznie nieznamienne korelacje. Nemoto odważa się twierdzić, że oznaczanie indeksu proliferacji PCNA może być obiektywną i ilościową miarą do oznaczania potencjału biologicznego niektórych guzów [19]. Średnie i maksymalne wartości indeksu proliferacyjnego PCN A i MIB-1 pozwalają odróżnić łagodne i złośliwe procesy nowotworowe, jak również, ocenić stopień histologicznego zróżnicowania raka prostaty [21 ]. Analiza kinetyki proliferacyjnej w raku prostaty pozwala nie tylko na dokładne określenie jego potencjału proliferacyjnego, ale również na lepsze oszacowanie biologicznej złośliwości, rokowanie oraz zastosowanie racjonalnej terapii.

piśmiennictwo

  1. [1] Zatoński W.. Tyczyński J.: Now roku. Biuletyn Centrum Onkolo< Curie, Centrum Onkologii. Wai
  2. [2] Weingartner K.. Riedmiller H.: [B] 1998,38, 186-193.
  3. [3]Wirth M. P., Froschermaier,S.E., radikalen Prostetektomie - Wann? Urologe [B]. 1998. 38. S 65-S 69.
  4. [4] Fainnan VI P.: DNA polymerase delta/PCNA: actions anil interactions. .1. Cell Sci„ 1990, 95, 1-4.
  5. [5] Domagała W.: Classical and new prognostic antl predictive factors in breast carcinoma. Nowotwory. 1996. 46, 669-690.
  6. [6] Hall P. A.. Levison D. A.: Review: assessment of cell proliferation in histological material. J. Clin. Patliol.1990, 43. 184-192.
  7. [7] Keim D. R.. Ilanash S. M.: Proliferating cell nuclear antigen: a new marker of proliferation in cancer. Leuk. Lymphoma. 1992, 6, 459-65.
  8. [8] Waseem N.H., Lane D. P.: Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Structural conservation and the detection of a nucleolar form J. Cell. Sci.
  9. [9] (icrdes J.. Schwab U.. Lemke H.. Stein H.: Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 1983,31, 13-20.
  10. [10] Cattorelti G., Becker N. M.. Key O: Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB-1 and M1B-3) delect proliferating cells in microwaveprocessed formalin-fixed paraffin sections. .1. Pathol. 1992, 168.357-363.
  11. [11] Gleason D. F.: Histological grading and clinical staging of prostatic carcinoma. Urologie Pathology: the prostate. Lea and Fe-higer. Philadelphia 1977.
  12. [12] Linden N. M., Torres F. X.. Kubus J.. Zabro R J.: Clinical Application of Morphologic and lmmunocylochemical Assessment of Cell Proliferation, Am. J. Clin. Pathol. 1992, 97, S4-SI3.
  13. [13] Maeda K., Chung Y.. Omoda N., Kato Y., Nina Arimoto Yamcda N., Hondo Y., Sowa M: Proliferating cell nuclear antigen labeWig index o/ preoperative biopsy specimens in gastric carcith with special reference to prognosis. Cancer. 1994. 73.528-53
  14. [14] Kawai T., Suzuki M., Kono S.. Shiromiya N.. Rokutanda Takagi K.. Ogata T., Tamai S.: Proliferating Cell Nuclear A gen and Ki-67 in lung carcinoma. Cancer 1994. 74. 2468-7
  15. [15] GafTney E. F., O\\\'Sullivan S. N.. O\\\'Brain A.: A major solid in ferentiuted carcinoma pattern correlates with tumor progres. in locally advanced prostatic carcinoma. HiSlOpathology. I1 21.249-255.
  16. [16] Helpap Li.: Prognosefaktoren des Prostatakaninoms- Der Pa loge. 1998. 19.42-52.
  17. [17] Slattin I\\\'., DamberJ. F... Karlbcrg L.. Bergh A.: Cell prolifen, assessed by Ki-67 Immunoreucliviry on formalin fixed tissiii a predictive factor for survival in prostate Cancer. J. Urol. 157,219-222.
  18. [18] Taylor C.R.. Shi S. R., Chaiwun B.. Young L.. Imam S. Cole R.J.: Strategies for improving the inimiinoliistochem staining of various intranuclear prognostic markers in jot lin-parulftn sections: androgen receptor, estrogen rece/ progesterone receptor, p.f.1 protein, proliferating cell nuc antigen, and Ki-67 antigen revealed retrieval techniques. H Pathol, 1994,25.263-270.
  19. [19] Ncmoto R.. Kawamura 11.. Miyakawa I., Uchida K.. Haltor Koiso K„ Harada .VI.: linmunohistocheinical detection of pre rating cell nuclear antigen (PCNA)/cyclin in human pro: adenocarcinoma. J. Urol. 1993.153. 165-169.
  20. [20] Galke VI.R W., Nisser-De Jong E.. Ten Kaltc F, J. W., Schr F. II., Kwast T. II.: Monoclonal antibody Ki 67 defined grt fraction in benign prostatic hyperplasia and prostatic. Cane Urol.. 1989. 142, 1342-1346.
  21. [21] Striepeckc E.. Ilandt S.. Efferl R, Gricfingholt H.. Bockint TV-bildanalytische Quanti/tierimg der Proliferationsfraktion, in benignen mid malignen Verdnderungen der Prostata: Vergl von Ki-67 und PCNA. Vcrh. Dtsch. Ges. Path., 1994, 78, 40

adres autorów

Zdzisław Skok
ul. Osiedlowa 3/6 85-799 Bydgoszcz