PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Niekrystaliczne składniki kamieni moczowych
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2003/56/1.

autorzy

Waldemar Różański 1, Leszek Klimek 2, Krzysztof Jakubowski 2, Eugeniusz Miękoś 1, Zbigniew Górkiewicz 2
1 Klinika Urologii i Rehabilitacji Urologicznej Instytutu Chirurgii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik kliniki: prof, dr hab. Eugeniusz Miękoś
2 Instytut Inżynierii Materiałowej Politechniki Łódzkiej w Łodzi
Dyrektor instytutu: prof, dr hab. inż. Piotr Kula

słowa kluczowe

układ moczowy, kamień moczowy, macierz organiczna, mikroskop skaningowy

streszczenie

dwie dekady to okres intensywnego rozwoju nowoczesnych metod leczenia kamicy moczowej. Większość prac, ukazujących się w piśmiennictwie światowym, dotyczy zagadnień związanych z technikOstatnieą i efektami stosowanego leczenia. Pragnąc zwrócić uwagę na inne aspekty kamicy moczowej, próbujemy zebrać i przedstawić informacje o niekrystalicznych składnikach kamieni moczowych i białkach wpływających na proces powstawania kamienia w drogach moczowych.
Wstęp Kryształy tworzące kamienie powstają w moczu zawierającym mieszaninę jonów, soli, makromolekuł i metabolitów. W różnych stanach chorobowych mogą pojawić się w moczu krwinki białe, czerwone (ryc. 1). bakterie (ryc. 2) i elementy rozpadających się komórek. Wymienione składniki moczu wpływają na powstanie, wzrost, agregację kryształów, jak również na ich zastój w nerkach, regulując w ten sposób powstanie i rozwój kamieni moczowych. Pojawiające się makromolekuły i elementy rozpadających się ciał komórkowych mogą wchodzić w skład macierzy organicznej kamieni moczowych (ryc 3). Macierz organiczna kamieni moczowych opisywana jest od 1684 roku. Stanowi ona od 2% do 9% suchej masy kamienia moczowego. W przypadku tak zwanych kamieni białkowych lub struwitowych zawartość macierzy organicznej w kamieniu jest zdecydowanie wyższa [1,2,3,4], W moczu chorych na kamicę moczową dominują kryształy szczawianu i fosforanu wapnia, a najczęściej spotykanymi makromo- lekularni są: białka, lipidy i glikozoaminoglikany. W celu wyjaśnienia zależności zachodzących między kryształami a makromolekularni, stosuje się najnowocześniejsze urządzenia badawcze. Pozwala to rozumieć proces krystalizacji i tworzenia się kamieni w drogach moczowych. Wprowadzenie badań chromatograficznych umożliwiło wykrycie w moczu i macierzy organicznej kamieni moczowych białek, których budowa aminokwasowa jest podobna do cząsteczki hemoglobiny. Obecność seryny w białkach macierzy organicznej może świadczyć o ich pochodzeniu z rozpadających się ciał bakteryjnych lub krwinek białych [5,6,7], Zastosowanie do badań struktury kamieni moczowych mikroskopu elektronowego pozwoliło uwidocznić wnikanie macierzy organicznej między kryształy. Badanie te potwierdziły, że pojedyncze kryształy i macierz organiczna są ściśle ze sobą powiązane, już na wczesnym etapie krystalizacji [8]. Głównymi składnikami makromolekuł w moczu i macierzy organicznej kamieni moczowych są białka odgrywające istotną rolę w procesie powstawania i rozwoju kamieni w drogach moczowych. Część z tych białek produkują komórki nabłonków kanalików nerkowych. Inne uwalniane są przez granulocyty w ogniskach zapalnych. Potwierdzają to badania Khana [8], który stwierdził, że szczawian wapnia może uszkadzać komórki nabłonka kanalików nerkowych działając na nie toksycznie lub mechanicznie. W wyniku przenikania kryształów w okolice błony podstawnej nabłonka kanalików nerkowych dochodzi do powstania ognisk zapalnych. Odpowiedzą organizmu na powstanie tych ognisk jest produkcja modulatorów krystalizacji. Uszkodzenie komórek nabłonka kanalików nerkowych powoduje uwalnianie do światła ne-fronu białek pochodzących z elementów organelli, błon i cyto-plazmy zniszczonych komórek. Białka te ulegają przemianom. Część z nich zostaje wydalona, a część wchodzi prawdopodobnie w skład macierzy organicznej kamieni moczowych jako płaszczyznowe lub włókniste formy pokrywające kryształy, które tworzą kamienie moczowe. Pojawiającym się w moczu białkom przypisywana jest rola inhibitorów lub promotorów procesu krystalizacji. Cel pracy Celem pracy jest przedstawienie niekrystalicznych składników kamieni moczowych oraz białek, biorących udział w procesie powstawania kamienia w drogach moczowych. Autorzy zamieścili własne zdjęcia powierzchni kamieni moczowych, wykonanych za pomocą mikroskopu skaningowego SEM 501 Philips (Eidhoven, Holandia) i S 3000 N Hitachi (Tokio, Japonia). Zawarte w tekście dane o białkach uczestniczących w procesie krystalizacji są tłumaczeniami oryginalnych prac prowadzonych przez Khana, Atmaniego. Tiseliusa. Tsujihata i innych cytowanych autorów. Białko Tamma-Horsfalla jest szczególnie dobrze znane, opisywane przez licznych autorów jako proteina występująca w moczu ludzi. Cząsteczka ma masę około 80 kDa, jednak różni autorzy podają masę od 60 do 95 kDa. Zbudowane jest z 616 aminokwasów. Zawiera 20% aminokwasów i 30% węglowodanów. Identyfikowane są w nim grupy sialowe i siarkowe. Dobowe wydalanie z moczem wynosi od 20 do 100 mg. Obserwowane jest w części grubej zstępującej pętli Henlego. Stopień polimeryzacji zwiększa się pod wpływem jonów wapnia i niskiego pH moczu. W zależności od pH moczu białko Tamma Horsfalla zmienia swoje własności. Przy wzroście sił jonowych i obniżeniu pH moczu spada jego aktywność - następuje wówczas jego żelili-kacja. Rola tego białka w patogenezie kamicy moczowej nie jest wyjaśniona. Opisywane jest jako promotor lub inhibitor krystalizacji kryształów szczawianowych i fosforanowych. Istnieją jednocześnie doniesienia mówiące, że nie ma ono wpływu na krystalizację szczawianu wapnia. Przy wzroście siły jonowej i pH moczu spada stężenie białka Tamma-Horsfalla, a zwiększa się krystalizacja szczawianu wapnia. Białko to, uzyskane z moczu ludzi chorych, zawiera więcej węglowodanów niż z moczu ludzi zdrowych. Istnieją sugestie (dotychczas jednak niepotwierdzone), że jest to sprawa dziedziczna. Punkt izoelektryczny tego białka wynosi u ludzi zdrowych 3,5, a u ludzi chorych na kamicę moczową waha się miedzy 4,5 a 6. Mimo obfitości, z jaką występuje w moczu, jedynie niewielkie jego ilości stwierdza się w macierzy kamieni moczowych (od 0.002 do 5.07 mg/g masy kamienia). W macierzy kamieni szczawianowych indukowanych in vitro w ludzkim moczu nie stwierdza się białka Tamma-Horsfalla. Występuje ono natomiast w kamieniach szczawianowych i fosforanowych, powstałych w układzie moczowym chorych na kamicę moczową. W badaniach na zwierzętach białko to lokalizowano na brodawkach nerkowych. Istnieją jednak znaczne różnice zdań co do jego wpływu na krystalizację: jedni uważają, że jest ono inhibitorem krystalizacji, dla innych promotorem, a inni twierdzą, że jest to białko obojętne dla procesu krystalizacji [9,10.11.12.13]. Nefrokalcyna jest kwaśną glikoproteiną. Opisana została przez Nakagawę. Jej masa cząsteczkowa wynosi 14 kDa. jednak ma ona tendencję do występowania w postaci wielkich cząstek, tworzących agregaty powielające jej masę cząsteczkową podstawową 23-30. 45-48. 60-68 kDa. tworząc dimery. trymery i tetramery. Podobnie jak białko Tam-ma-Horsfalla. nefrokalcyna wiąże zjonizowany wapń i magnez. Uzyskuje się ją podczas dializy kamieni moczowych w EDTA. Zawiera około 110 aminokwasów, w tym w 2 5% to kwas glutaminowa\\\' i asparaginowy. Dodatkowo zawiera dwie cząsteczki cysteiny, oraz dwie lub trzy cząsteczki kwasu gamma-karboksyglutaminowego. co może uzasadnić jej hamujące działanie w krystalizacji szczawianu wapnia. Węglowodany stanowią około 10.3% jej masy. Otrzymuje się ją z ludzkiego moczu, z hodowli tkanek nerkowych ludzi, z komórek raka nerki, z cewek proksymalnych nefronów mysich i szczurzych. Metodami immunohistochemicznymi wykazano, że lokalizowana jest na ścianach nabłonków kanalików nerkowych proksymalnych i części wstępującej pętli Henle-go. Dobowe wydalanie z moczem wynosi od 5 do 16 mg. Przypuszcza się, że jest ona jako inhibitor odpowiedzialna w 90% za proces krystalizacji jednowodnego szczawianu wapnia. Wpływa na proces powstawania jąder, jak i przyrostu masy kamienia. Wraz ze wzrostem siły jonowej środowiska zmniejszają się jej własności hamujące. Dodatkowo osłabia siły przylegania layształów jednowodnego szczawianu wapnia do ścian komórkowych nabłonków dróg moczowych. Jej budowa jest podobna do osteokalcyny, obficie występującej w kościach, jednak nefrokalcyna nie zawiera kolagenu. Za produkcję osteokalcyny odpowiadają trzy geny: OG1, OG2 i ORG. Dwa pierwsze znajdują się tylko w kościach, a trzeci ORG w nerkach. Istnieją doniesienia, że gen ORG jest odpowiedzialny za powstawanie nefrokalcyny w nerkach. Ostatnio sugeruje się, że nefrokalcyna jest łańcuchem lekkim intcr-alfa-trypsyny, jednak nie zawiera kwasu gamma-karboksyglutaminowego [9.10,11,14]. Inter-alfa-inhibitor (nazywany bikuiną), został zidentyfikowany w kamieniach moczowych. Jest to białko posiadające masę 220 kDa. pochodzi z plazmy komórkowej, cząsteczka zbudowana jest z trzech łańcuchów: dwóch ciężkich HI 78 kDa i H2 8 5 kDa oraz z lekkiego łańcucha III 30 - 45 kDa. Ib trzy łańcuchy tworzą unikalny kompleks wrażliwy na chondroitynazę. Syntetyzowany jest w wątrobie i wydzielany do osocza. Za pomocą reakcji immunologicznych zidentyfikowano go w wątrobie, nerkach, jądrach, jelitach, skórze i w mózgu, lecz mRNA dla tego inhibitora znaleziono tylko w wątrobie. W nerkach inter-alafa-inhibitor występuje w kanalikach proksymalnych, co sugeruje, że jest wchłanianym zwrotnie w tym odcinku nefronu. Przeciętne stężenie inter-alfa-inhibitora w osoczu zdrowego człowieka wynosi 450 mg/l. Dobowe wydalanie z moczem wynosi od 2 do 10 mg/dobę, lecz może wzrastać od 50 do 100 mg/dobę i więcej w niektórych stanach chorobowych (nowotworach). Jego stężenie w osoczu obniża się w niewydolności nerek. Wszystkie jego łańcuchy są odnajdywane w macierzy organicznej kamieni moczowych. Inter-ałfa-inhibitor uważany jest za inhibitor krystalizacji kryształów szczawianu wapnia. Prawdopodobnie jest on opisywanym przez innych białkiem bogatym w kwas uronowy (IIPA). Podobieństwo między inter-alfa-inhibitorem a białkiem bogatym w kwas uronowy potwierdzono, stosując reakcje immunologiczne z poliklonaln5\\\'mi przeciwciałami. Bikuina. pochodząca od ludzi chorych na kamicę moczową, jest słabszym inhibitorem krystalizacji niż pochodząca od ludzi zdrowych [9.10.12J. Osteopontyna jest fosfoproteiną niekolagenową izolowaną z kości, produkowaną przez osteoblasty. Jej masa cząsteczkowa wynosi od 44-75 kDa. W jej skład wchodzi 3.19 aminokwasów, w tym 36% to kwas asparginowy i glutaminowy. Zawiera 30 cząsteczek seryny i 12 cząsteczek fosfo-seryny. Węglowodany stanowią 16.6%. Zawiera również 10 reszt kwasu sialowego. mannozę. N-acetylogalaktozę. Interesującą częścią cząsteczki osteopontyny jest sekwencja Arg-Gly-Asp (RGD). która - jak się przypuszcza - łatwo tworzy połączenia z receptorami komórkowymi alfaYbe-t.a3. Osteopontyna zidentyfikowana została w nerkach, przewodzie pokarmowym, pęcherzyku żółciowym, trzustce, płucach i śliniankach. Stosując metody immunologiczne, zidentyfikowano jej obecność w nerkach w części wstępującej pętli Henlcgo, na brodawkach nerkowych i nabłonkach sklepień kielichów. Zdrowy człowiek wydala z moczem od 2.4 do 3.7 mg osteopontyny na dobę. Synteza jej jest kontrolowana przez 1,25-dihydroksywitaminę D3 i angiotensynę II. Izolowana z moczu osteopontyna jest. glikoproteiną o masie cząsteczkowej 50 kDa: nazywana jest uropontyną-Przypuszcza się. że pontyny regulują procesy biominerali-zacji tkanek. Uropontyna uważana jest za inhibitor krystalizacji jednowodnego szczawianu wapnia, i odpowiada za wzrost jego kryształów. Może ona być. jak się sądzi, inhibitorem powstawania heterogennych jąder krystalizacji. Wykazano również, że odpowiada za przyleganie kryształów szczawianu wapnia do komórek kanalików nerkowych. Osteopontyna stanowi znaczącą część macierzy organicznej kamieni szczawianowych, W 100 mg kamieni z jednowodnego szczawianu wapnia znajduje się 800 ug osteopontyny. a w 100 mg kamieni z dwuwodnego szczawianu wapnia zaledwie 10 ug. Bierze udział we wszystkich fazach powstawania kamieni szczawianowych i fosforanowych [8.9,11.15,16.171. Fragment 1 protrombiny moczowej jest białkiem o masie cząsteczkowej 31 kDa. które wyizolowano z kamieni szczawianowych. Podobny jest do protrombin osocza, biorących udział w procesie krzepnięcia. Zawiera 154 aminokwasy, w tym 23% kwasu glutaminowego i asparginowe-go. Węglowodany stanowią 1 7% jego masy. W ciągu doby z moczem wydziela się 13,4 nM. a u ciężarnych kobiet wzrasta do 47,2 nM. Zlokalizowano go w pętli Henlego i w okolicy plamki gęstej (macula dema). Prawdopodobnie jest jednym z inhibitorów krystalizacji szczawianów wapnia [9,11,17], Albuminy osocza to białka o masie cząsteczkowej około 68 kDa. Białka te mają wysokie powinowactwo do kryształów szczawianu wapnia. W niewielkim stopniu wpływają na agregacje kryształów szczawianu wapnia. Wiążą się z kryształami tworzącymi kamień moczowy lub ułatwiają wiązanie kryształów z innymi białkami. W ciągu doby z moczem wydala się od 1.6 do 34,2 mg. Identyfikowane są w kamieniach moczowych [9.21]. Fibronektin o masie około 2 30 kDa jest wielofunkcyjną alfa-2-glikoproteiną występującą w płynach ustrojowych zewnątrzkomórkowych. W osoczu osiąga stężenie 300 ug/ml. U zdrowych ludzi wydzielany jest z moczem w ilości 0.5 ug/ml. Występuje w hepalocytach. fibroblastach. w nabłonkach naczyń krwionośnych, w komórkach nabłonka kłębuszków nerkowych. Jego poziom wyraźnie wzrasta u chorych na cukrzycę, choroby nowotworowe, szczególnie przy istniejących przerzutach. Fibronektin zmniejsza efekt agregacji kryształów szczawianu wapnia i ich przyleganie do błony komórkowej nabłonka dróg moczowych [22]. Glikozoaminoglikany tworzą warstwę ochronną pokrywającą nabłonek dróg moczowych. Udowodniono wpływ glikozoaminoglkanów i innych powierzchniowych polisacharydów na proces powstawania kamieni w drogach moczowych. Dobowe wydalanie z moczem glikozoamino-glikanów wynosi 11.5 mg. Ich rola w macierzy organicznej nie jest do końca wyjaśniona. Mogą one pełnić rolę inhibitorów krystalizacji kamieni szczawianowych. Ich masy cząsteczkowe wahaj ą się od 18 do 40 kDa. Stwierdzono, że siarczan heparyny wchodzi w skład macierz}\\\' organicznej kamieni szczawianowych. a nie stwierdzono go w kamieniach struwitowych. W macierzy organicznej kamieni moczowych identyfikuje się takie glikozoaminoglikany, jak siarczan chondroityny A. B. C. kwas sialowy i kwas hialurono-wy [18.19.20], Wydalane z moczem cząsteczki białek wykazują różne własności. Wiele z nich wpływa na proces powstawania kamieni w drogach moczowych. Białka, takie jak: oste-opontyna czy białko Tamma-Horsfalla, są wydalane przez komórki kanalików nerkowych. Inne. np. fragment 1 pro-trombiny moczowej czy bikuina. powstają poza układem moczowym, jednak mogą pojawić się w nerkach. Poziom tych białek w moczu regulowany jest przez wydalanie elektrolitów. Osteopontyna. kwas hialuronowy (glikozoamino-glikan) oraz fragment 1 protrombiny moczowej wchodzą w skład macierzy organicznej. Białko Tamma-Horsfalla i siarczan keratanu (glikozoaminoglikan) pozostają na powierzchni kryształów, stanowiąc niewielką część macierzy organicznej. Białka, regulujące proces krystalizacji, są cząstkami o dużej gęstości ładunku elektrycznego i silnym powinowactwie do kryształów, w połączeniu z którymi przyjmują formę anionu. Własności te wpływają na proces powstawania zarodków jądrowych kryształów i dalszy wzrost kamienia [9]. Zdjęcia z mikroskopu skaningowego wykonali autom- podczas badań struktury kamieni moczowych, prowadzonych w ramach współpracy Politechniki Łódzkiej ?. Wojskową Akademią Medyczną w Łodzi.

piśmiennictwo

  1. 1. Morse RM, ResnickMJ: Urinary stone matrix. JUrol 1988; ] 39: 602-605.
  2. 2. Koide T, Miyagawa M. Kinoshila K: Matrix stones. J Urol 1977:117: 786-787.
  3. 3. Allen TD. Spence MH: Matrix stones. J Urol 1966; 95: 284-290.
  4. 4. VarmaJS: Matrix calculus anuria. Brit JUrol 1987; 59:190-191.
  5. 5. Kim KM: Mulberry particles formed by red blood cells in human weddeli-te stones. JUrol 1983; 129:855-857.
  6. 6. Stapleton AMP, Ryall RL: Blood coagulation proteins and urolithiasis are linked: ctystal matrix protein is the F 1 activation peptide of human prothrombin. Brit J Urol 1995: 75: 712-719.
  7. 7. Petersen TK. Thogersen JDA. Petersen SE: Identification of hemoglobin and two serine proteases in acid extracts of calcium containing kidney sto-nesJUrol 1989:142:176-180.
  8. 8. Khan SR: Tubidar cell surface events during nephrolitluasis. Curr Opin Urol 1997; 7:240-247.
  9. 9. Khan SR: Interactions between stone forming calcific crystals and macro-molecules. Urol Int 1997: 59: 59-71.
  10. 10. Almani E Lacour B, Daudon M: Uronic-acid-rich protein: une novelle glycoprotein inhibitrice de la cristallisation de 1\\\'oxalate de calcium in vitro. Nephrol 1996; 17:157-162.
  11. 11. Tiselius HG: Macromolecidar substances - their role in urolithiasis. Curr Opin 1997: 7: 234-239.
  12. 12. Atmani F. Lacour B, Drueke T. Daudon M: Isolation and purification of a new glycoprotein from human urine inhibiting calcium oxalate crystallization. Urol Resea 1993; 21; 61-66.
  13. 13. Grover PK. Resnick MJ: Evidence for the presence of abnormal proteins in the urine ofrecurrent stone formers. JUrol 1995; 153:1716-1721.
  14. 14. Mustafi D. Nakagawa Y: Characterization ofCa2+ binding sites in the kidney stone inhibitor glycoprotein nephrocalcin using vanadyl ions: different matal binding properties in strong and weak inhibitor proteins reve-aledby EPRandENDOR. Kiachem 1996: 35:14703-14709.
  15. 15. Sorensen S, Justesen SJ. Johnsen AU: Identification of a macromolecu-lar crystal growth inhibitor in human urine ae steopontin. Urol Res 1995:23:327-334.
  16. 16. Gokhale JA, Glenlon PA. Khan SR: Locahaaion ofTamm-Horsfall protein and osteoponlbun rat nephrolitluasis model. Nephron 1996: 73: 456-461.
  17. 17. Nishio S, Hatanaka M, Takeda H. Iseda T. Iwata H. Yokoyama M: Analysis of urinary concentrations of calcium phosphate crystal - associated proteins: alfa-2-HS-glycoprotein prothrombin F 1 and osteopontin. J Am Soc Nephrol 1999; 10: 394-396.
  18. 18. Nishio S. Abe Y, Wakatsuki A. Iwata H, Ochi K, Takcuchi M. Matsu-moto A: Matrix glycosaminoglycan in urinary stones. J Urol 1985: 134: 503-506.
  19. 19. Iwata H, Kamei O. Abe Y. Nishio S. Wakatsuki A. Ochi K Takeuclii M: The organic matrix of urinary uric acid crystals. J Urol 1988:139: 607-610.
  20. 20. Sarica K, Turkolmez K. Kupeli B, Akpoyraz M. Durak I, Kupeli S, Ko-sar A: Glycosaminoglycan content of Ca-oxtdate stone matrix. Urol Int 1997:58:43-46.
  21. 21. Cerini C. Geider S. Dussol B, Hennequin C, Daudon M, Veesler S, Nit-sche S. oistelle R, Berlhezene P. Dupuy P, Ań A, Beiiand Y, Dragom J. C, Verdier JM: Nucleation of calcium oxalate crystals by albumin: involvement in the prevention of stone formation. Kid Internal 1999: 55: 1776-1786.
  22. 22. Tsujihata M. Miyake 0. Yoshimura K. Kakimoto KI, Takahara S. Okuyama A: Fibronectin as a potent inhibitor of calcium oxalate urolithiasis. JUrol 2000:164:1718-1723.

adres autorów

Waldemar Różańskt
Klinika Urologii i Rehabilitacji Urologiczne! Uniwersyteckiego Szpitala
Klinicznego Nr 2 int. Wojskowej Akademii Medycznej
ul. Żeromskiego 113
90-549 Łódź