PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Badanie immunohistochemiczne cholecystokininy (CCK-8) w układzie płciowym męskim szczura w przebiegu rozwoju postnatalnego (komputerowa analiza obrazu morfologicznego)
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2002/55/4.

autorzy

Bogdan Miśkowiak 2, Andrzej Limanowski 1, Małgorzata Partyka 1, Aneta Konwerska
1 Katedra i Zakład Histologii i Embriologii Akademii Medycznej w Poznaniu Kierownik katedry: prof, dr hab. Andrzej Łukaszyk
2 Katedra Optometrii i Biologii Układu Wzrokowego Akademii Medycznej w Poznaniu Kierownik katedry: prof, dr hab. Bogdan Miśkowiak

słowa kluczowe

układ płciowy męski, jądro, najądrze fr prostata, pęcherzyki nasienne | cholecystokinina (CCK-8), rozwój postnatalny, analiza komputerowa obrazu

streszczenie

Cel pracy. Celem pracy było wykrycie obecności, lokalizacji i roli cholecystokininy (CCK-8) w układzie płciowym samca szczura w
przebiegu rozwoju postnatalnego. Materiały i metody. Oznaczono immunocytochemicznie lokalizację cholecystokininy (CCK-8) w jądrach, kanałach najądrza, pęcherzykach
nasiennych i brzusznych prostatach szczurów od urodzenia do osiągnięcia dojrzałości płciowej. Intensywność reakcji w komórkach
sekrecyjnych określano korzystając z programu komputerowego, wykazującego gęstość optyczną uzyskanego odczynu. Wyniki. Komórki w nabłonku gruczołowym wykazujące obecność CCK-8 obserwowano od 20. dnia w prostacie i 35. dnia w kanale
najądrza w obszarze odpowiadającym aparatowi Golgiego komórek. W pęcherzykach nasiennych immunopozytywny odczyn pojawił
sic w 35. dniu i występował we wszystkich badanych okresach w całej cytoplazmie komórek nabłonkowych. Nie obserwowano CCK-8-
immunopozytywnych substancji ani w przedziale śródmiąższowym, ani gametogenicznym jądra. Wnioski. Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że CCK-8 wywiera wpływ na wzrost i różnicowanie się kanału najądrza,
pęcherzyków nasiennych i brzusznej prostaty.
WSTĘP Cholecystokinina, znana od dawna jako regulator czynności sekrecyjnej w układzie pokarmowym [1,2], okazała się czynnikiem występującym w wielu narządach, wywierając między innymi wpływ na procesy proliferacji i różnicowania się komórek na drodze parakrynowej [5,14]. Cholecystokininę wykryto w obrębie centralnego układu nerwowego - w mózgu, w neuroependymic, jądrach podwzgórza i hypokampie [3,4]. Opisana w korze nadnerczy i części korowej grasicy cholecystokinina A wpływała stymulująco na proliferację komórek w tych narządach [5]. Obecność cholecystokininy wykazano również w obrębie układu płciowego męskiego - w jądrze i najądrzu [6,7]. Ostatnio w obrębie narządów układu płciowego męskiego wykryto obecność komórek neuroendokrynowych [8], wydzielających liczne neuropeptydy, na przykład neu-ropeptyd Y, bombezynę i inne [9,10,11]. Czynniki te, działając parakrynowo, miałyby wpływać na procesy różnicowania się i wzrostu między innymi narządów płciowych dodatkowych. Obecność receptorów dla cholecystokininy wykryto także w licznych nowotworach, w tym również w komórkach neuroendokrynowych, zlokalizowanych w złośliwych guzach prostaty [12,13,14]. W dostępnej literaturze mało jest danych, dotyczących występowania i roli cholecystokininy w narządach układu płciowego męskiego; traktujących zaś o zachowaniu się tego pepfydu w przebiegu rozwoju postnatalnego gruczołów płciowych dodatkowych - nic spotkaliśmy wcale. CEL PRACY Biorąc powyższe pod uwagę, postanowiliśmy - przy zastosowaniu metody immunocytochemicznej - przebadać lokalizację cholecystokininy oraz określić jej rolę w przebiegu postnatalnego rozwoju jądra, kanału najądrza, pęcherzyków nasiennych i prostaty szczura. MATERIAŁ I METODY Badania przeprowadzono na szczurach samcach rasy Wistar, które przebywały w stałych warunkach bytowania, w temperaturze 20 ± 2°C i oświetleniu 10L - 14D, otrzymując paszę i wodę ad libidum. W 1., 5., 10., 20., 28., 35., 45. i 59. dniu życia szczury uśmiercano w narkozie eterowej przez wykrwawienie. Do badań histologicznych pobierano jądra, pęcherzyki nasienne, najądrza i brzuszne prostaty, które ważono, a ich wycinki po utrwaleniu w płynie Bouin\\\'a zatapiano w parafinie. W każdym analizowanym przez nas okresie badanych było 6 zwierząt. Na skrawkach wykonywano reakcje immunocytochc-miczne na obecność cholecystokininy-8 (CCK-8) metodą lmmunomax (Catalysed Signal Amplification, DAKO). Zastosowano królicze przeciwciała przeciw C - końcowemu oktapeptydowi cholecystokininy - anty-CCK 8 (Sigma) w rozcieńczeniu 1: 2500. Kontrolę uzyskiwanych reakcji immunohistochcmicznych stanowiła procedura, w której zamiast przeciwciała swoistego anty CCK-8 stosowano królicze IgG. Pomiary gęstości optycznej {optical density mean) przeprowadzono pod powiększeniem 600x, przy użyciu programu komputerowego do automatycznej analizy obrazu Micro Image 4.0 firmy Olympus oraz mikroskopu Opti-phot-2 firmy Nikon, wyposażonego w kamerę kolorową TV CCD. Jak wiadomo, gęstość optyczna jest proporcjonalna do ilości wykrywanego immunocytochemicznie produktu reakcji, czyli pośrednio do intensywności odczynu immunocytochemicznego. Wykonywano minimum 30 pomiarów gęstości optycznej odczynu w każdej grupie wiekowej badanych szczurów. Na każdym preparacie dokonano również pomiaru gęstości optycznej tła, która następnie została odjęta od gęstości optycznej odczynu. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy zastosowaniu testu t-Studenta. WYNIKI Zachowanie się odczynu immunocytochemicznego na cholecystokininę (CCK-8) w obrazie histologicznym ilustrują ryciny 1-3, a wyniki pomiarów gęstości optycznej odczynu w obrębie badanych narządów podano na wykresie I. Pozytywna reakcja immunocytochemiczna na obecność CCK-8 występuje w komórkach nabłonkowych w najądrzu, pęcherzykach nasiennych i brzusznej prostacie, nie udało się jej zaś wykazać w obrębie jądra. W najądrzu odczyn na obecność CCK-8 pojawia się w strefie nadjądro-wej, odpowiadającej aparatowi Golgiego, komórek nabłonka gruczołowego począwszy od 35. dnia życia (ryc. 1), a gęstość optyczna odczynu stopniowo wzrasta, uzyskując najwyższą wartość w 59. dniu życia. W tym samym okresie pojawia się immunopozytywny odczyn w pęcherzykach nasiennych, występując w obrębie całej cytoplazmy komórek nabłonka gruczołowego, szczególnie silny jest w obrębie strefy nadjadrowej, odpowiadającej aparatowi Golgiego (ryc. 2). Gęstość optyczna reakcji osiąga najwyższą wartość w 35. dniu życia, i następnie stopniowo nieznacznie się obniża. W brzusznej prostacie immunocytochemiczna reakcja na CCK-8 pojawia się najwcześniej 2. dnia życia, lokalizując się w strefie nadjadrowej komórek nabłonka gruczołowego (ryc. 3). Gęstość optyczna reakcji osiąga najwyższą wartość w 59. dniu życia. OMÓWIENIE sSMBR ■ i»*i,; ■r.y-» *>i~s- \\\\-V.IP > iv,\\\".* V 5 Ryt. 2. W obrębie całej cytoplazmy w większości komórek pęcherzyków nasiennych szczura 35-dniowego występują CCK- immunopozytywne substancje (pow. 200x). W badaniach własnych wykazaliśmy, że postnatalny rozwój jąder, najądrzy i brzusznej prostaty nie przebiega w sposób ciągły, lecz skokowo w trzech dających się wyróżnić okresach. Podobnie obserwuje się trzy okresy wahania się poziomu testosteronu w surowicy krwi: wysoki w dniach 1.-10. i 45.-59. oraz obniżony w dniach 20.-35. [15,16,17]. W przeprowadzonych badaniach nie udało się nam wykazać obecności immunocytochemicznego odczynu na cholecystokininę (CCK-8) w jądrze, w żadnym z badanych okresów rozwoju postembrionalnego. Gu i wsp. [18], w badaniach opublikowanych w 1983 roku, nie wykazali obecności CCK w narządach układu płciowego człowieka. Nowsze badania (Schalling i wsp.) wykazały obecność CCK w obrębie akrosomów ludzkich plemników oraz innych ssaków [6]. Peptyd ten - według wymienionych autorów - miałby odgrywać ważną rolę w procesie dojrzewania plemników. Podobnie Pelto i wsp. [7] wykazali obecność CCK w akrosomach plemników u małp, w spermatocytach u małp i myszy oraz w najądrzu tych zwierząt. Receptory CCK-B wykryto w komórkach neuroendo-krynowych nowotworów ludzkiej prostaty [12,13]. CCK miałaby być odpowiedzialna za skurcz mięśniówki i sekrecie egzokrynową w układzie moczowo-płciowym. Podobnie Petit i wsp. [14] wykazali obecność receptorów CCK w komórkach nowotworowych ludzkiej prostaty. Według nich CCK wywierałaby działanie na drodze auto- i parakryno-wej, stymulując wzrost nowotworu. Opisany przez nas im-munocytochemiczny odczyn na CCK-8 zlokalizowany jest w aparacie Golgiego komórek nabłonka gruczołowego kanału najądrza i prostaty oraz w cytoplazmie komórek nabłonka gruczołowego pęcherzyków nasiennych. Opierając się na doniesieniu Aumullera [8], który w obrębie nabłonka gruczołowego prostaty szczura wyróżnił komórki podstawowe, wydzielnicze, śluzowe i neuroendokrynowe, sądzimy, że opisany w niniejszej pracy odczyn na CCK zlokalizowany jest w komórkach neuroendokrynowych nabłonka gruczołowego badanych narządów. Immunocytochemiczna reakcja na CCK-8 nie występowała w naszych badaniach w początkowych okresach życia pozapłodowego. Najwcześniej pojawia się w prostacie 20. dnia, osiągając najwyższą wartość optyczną w 59. dniu życia, to jest u zwierząt dojrzałych płciowo. W kanale najądrza i pęcherzykach nasiennych odczyn immunopozylywny pojawia się w 35 Wykres. 1. Gęstość optyczna immunocytochemicznego odczynu na CCK-8 w najądrzu, pęcherzykach nasiennych i prostacie w badanych okresach rozwoju post-natalnego szczura. Wyniki podano jako wartości średnie ± SD. dniu życia, przy czym w najądrzu gęstość optyczna odczynu stopniowo się zwiększa, a w pęcherzykach nasiennych ulega stopniowemu osłabieniu w miarę dojrzewania tych narządów. Powyższe dane korespondują z wynikami badań własnych nad rozwojem postnatalnym najądrza [16] i prostaty [17], przeprowadzonymi przy wykorzystaniu komputerowej analizy obrazu histologicznego. Wykazaliśmy tam, że obraz morfologiczny prostaty jest zbliżony do obrazów spotykanych u szczurów dojrzałych płciowo już w 20. dniu życia, a kanału najądrza w 45. dniu życia. Aumuller [8] stwierdził, że prostata szczura przejawia działalność sekre-cyjną już w 12. dniu życia. Obserwowane przez nas pojawienie się odczynu na CCK-8 w 20. dniu życia w prostacie (nie można wykluczyć, że pojawił się już on między 10. a 20 dniem) oraz w 35. dniu w kanale najądrza, a więc w okresie, kiedy obraz morfologiczny tych narządów jest zbliżony do spotykanego u zwierząt dojrzałych płciowo, przemawia za udziałem tego neuropeptydu w stymulowaniu wzrostu i różnicowania tych narządów [15]. WNIOSKI 1. W rozwoju postnatalnym kanału najądrza, prostaty i pęcherzyków nasiennych szczura pojawienie się im-munocytochemicznego odczynu na CCK-8 wyprzedza nieznacznie moment, w którym prostata i kanał najądrza wykazują obraz histologiczny zbliżony do normy (20. dzień w prostacie i 35. w kanale najądrza). 2. Odczyn immunocytochemiczny na CCK-8 zlokalizowany jest w aparacie Golgiego komórek neuroendo-krynowych nabłonka gruczołowego kanału najądrza i prostaty. 3. Zachowanie się i lokalizacja odczynu na CCK-8 w pęcherzykach nasiennych jest odmienne. Najwyższa gęstość optyczna odczynu na CCK-8 występuje między 45. a 59. dniem życia, zaś odczyn - w całej cytopla-zmie. 4. CCK może być neuropeptydem odpowiedzialnym za rozwój i różnicowanie się nabłonka gruczołowego gruczołów płciowych dodatkowych w rozwoju postnatalnym szczura samca.

piśmiennictwo

  1. 1. Burckhardt B, Delco F, Ensinck JW. Meier R, Bauerfeind P. Aufclerhaar U, Ketterer S, Gyr K, Beglinger C: Cholecyslokinin is a phy-sioiogica! regulator ofgastric acid secretion in man. Eur J Clin Invest 1994; 24:370-376.
  2. 2. Fink H, Rex A, Voits M, Voigt JP:Major biological actions ofCCKa critical evaluation of research findings. Exp Brain Res 1998; 123; 77-83.
  3. 3. Facchinetti P, Rose C, Rostaing P. Triller A, Schwartz JC:fmmunolocalization of tripeptidyl peptidase ff, a cholecystokinin-inactivating enzyme, in rat brain. Neuroscience 1999; 88: 1225-1240.
  4. 4. Straus E, Ryder S, Eng J, Yalow RS:Nature of immunoreactive CCKin rat and pig brain. Peptides 1981; 2:89-92.
  5. 5. Malendowicz LK, Tretjcr M, dc Caro R, Jędrzejczak N, Bielińska
  6. R, Markowska A, Nussdorfer GG, Nowak M. Cholecyslokinin, acting through the A receptor subtype, stimulates the proliferative activity of adrenocortical cells and thymocytes in the rat. Histol Histopa-thol 1999; 14: 439-443.
  7. 6. Schalling M, Persson II, Pelto-Huikko M, Odum L, Ekman P, Gottlieb C, Hokfell T, Rehfeld JF:Expression and localization of gastrin messenger UNA and peptide in spennatogenic cells. J Clin Invest 1990; 86: 660-669.
  8. 7. Pelto-Huikko M, Persson II, Schalling M, Rehfeld JF, Ilokfell T:fmmunocylochemical demonstration of cholecystokinin-like immu-noreactivity inspermatozoa in monkey testis and epididymis. Acta Physiol Scand 1989; 137:465-466.
  9. 8. Aumiiller G: Postnatal development of the prostate. Bull Assoc Anal(Nancy) 1991;75:39-42.
  10. 9. Acosta S, Dizeyi N, Pierzynowski S, Aim P. Abrahamsson PA: Neuroendocrine cells and naves in the prostate of the guinea pig: effects of peripheral denervation and castration. Prostate 2001; 46:191-199.
  11. 10. di Sant\\\'Agnesc PA: Calcitonin-like immunoreactive and bombesin--like immunoreactive endocrine-paracrine cells of the human prostate. Arch Pathol Lab Med 1986; 110:412-415.
  12. 11. Jen PY, Dixon JS: Development of peptide-containing nerves in the human fetal prostate gland. J Anat 1995; 187:169-179.
  13. 12. Rcubi JC, Schaer JC, Waser B:Cholecyslokinin (CCK)-A and CCK-Blgastrin receptors in human tumors. Cancer Res 1997; 57: 1377-1386.
  14. 13. Cecio A, Cocca T, Masotti MT, La Mura E, Vittoria A: CCK-con-tabling paraneumns in human adenomatous prostate. Biosci Rep 1993; 13: 251-258.
  15. 14. Petit X Davidson KK, Lawrence RA, von Hoff DD, Izbicka E: Neuropeptide receptor stains in human tumor cell lines. Anticancer Drugs 2001; 12:133-136.
  16. 15. Otulakowski B, Limanowski A, Miśkowiak B, Partyka M, Konwerska A. Moiphomemc studies on rat testes in the course of postnatal dewlopment. Folia Morphol 1999; 58: 69-77.
  17. 16. Limanowski A, Miśkowiak B, Otulakowski B, Partyka M, Konwerska A: Moiphometiic studies on rat epididymis in the course of postnatal development (computerised image analysis). Folia Histochem el Cytobiol 2001; 39: 201-202.
  18. 17. Otulakowski B, Limanowski A, Miśkowiak B, Partyka M, Konwerska A:Badania moifometiyczne brzusznej prostaty szczura w pize-biegu rozwoju postembrionalnego (komputerowa analiza obrazu morfologicznego). Uroi Pol 2001; 54: 44-48.
  19. 18. Gu J, Polak JM, Probert L, Islam KN, Marangos PJ, Mina S, Adrian TE, McGregor GP, O\\\'Shaughnessy DJ, Bloom SR:Peptidergic inneivation of the human male genital trad. J Urol 1983: 130; 386-391.

adres autorów

Bogdan Miśkowiak
Katedra i Zakład Htsiologii i Embriologii AM
ul. Święcickiego 6
60-781 Poznań
tel (0-61) 86-99-181 w. 546
fax (0-61) 86-58-130
e-maih bmiskow@am.poznan.pl