Wprowadzenie
Rak pęcherza moczowego jest w Polsce czwartym pod względem częstości rejestrowania nowotworem złośliwym wśród mężczyzn (6,1%) i siedemnastym wśród kobiet (1,6%) [1]. U mężczyzn zgony z powodu raka pęcherza moczowego są na piątym miejscu wśród zgonów z przyczyn nowotworowych (4,3%) [1].
Badania epidemiologiczne wykazały, że od 60% do 70% przypadków raka pęcherza moczowego jest zależnych od ekspozycji na karcynogeny chemiczne, których najważniejszym źródłem jest palenie tytoniu i narażenie zawodowe. Najbardziej zagrożonymi grupami zawodowymi są: pracownicy przemysłu tekstylnego, farbiarskiego, chemicznego, gumowego, skórzanego, malarze, fryzjerzy, pracownicy stacji benzynowych i kierowcy ciężarówek [2]. Według danych z lat 1971-1994 w Polsce obserwuje się zwiększoną zapadalność na raka pęcherza moczowego wśród pracowników przemysłu chemicznego, gumowego, metalurgicznego i gazowniczego [3].
Charakterystyczną cechą guzów pęcherza moczowego jest wysoka częstość nawrotów raka po pierwotnej resekcji. Dlatego istotnym aspektem opieki nad chorymi na raka pęcherza moczowego jest monitorowanie nawrotów guzów. W praktyce klinicznej rutynowym badaniem w rozpoznawaniu pierwotnych i nawrotowych guzów pęcherza moczowego jest cystoskopia. Ostateczne rozpoznanie stawiane jest po resekcji guza i określeniu przez histopatologa stage i grade nowotworu. Mimo że cystoskopia jest uznawana za złoty standard w diagnozowaniu raka pęcherza moczowego, nie umożliwia wykrycia wszystkich przypadków guza. Podstawowym badaniem uzupełniającym w stosunku do cystoskopii jest cytologia osadu moczu. Jest to metoda nieinwazyjna, charakteryzująca się wysoką swoistością (średnio około 94%), ale niską czułością (średnio około 55%) [4]. Czułość badania cytologicznego jest szczególnie niska dla powierzchownych, wysokozróżnicowanych guzów pęcherza moczowego (pTa -T1G1). Dodatkowo wiarygodność wyniku badania cytologicznego osadu moczu zależy od doświadczenia osoby wykonującej badanie. Z powyższych powodów wielu badaczy na całym świecie poszukuje łatwego w interpretacji testu, który mógłby uzupełnić lub zastąpić badanie cytologiczne przy diagnozowaniu raka pęcherza moczowego. Proponowane testy można podzielić na: oceniające morfologię komórek, wykrywające antygeny charakterystyczne dla raka pęcherza moczowego i badania genetyczne. Testem zaaprobowanym przez FDA do diagnozowania raka pęcherza moczowego jest test UroVysion, uwzględniający zarówno morfologię komórek w osadzie moczu, jak i charakterystyczne aberracje chromosomowe oceniane przy pomocy techniki FISH (ang. Fluorescence In Situ Hybridization).
Badania genetyczne w przypadkach raka pęcherza moczowego
Inicjacja i progresja choroby nowotworowej jest związana z występowaniem zmian na poziomie genomu komórki. Badania prowadzone już od lat sześćdziesiątych XX wieku [5] pozwoliły na stwierdzenie, że w komórkach raka pęcherza moczowego występują liczne aberracje chromosomowe - zarówno liczbowe, jak i strukturalne. Zauważono, że utrata części lub całego chromosomu 9 jest najczęściej występującą aberracją [6-14]. Inne częste aberracje dotyczą chromosomów 1, 3, 4, 7, 8, 11, 15, 17, 18 i Y [6-13]. Celem licznych projektów badawczych było wykrycie korelacji między specyficznymi aberracjami chromosomowymi a ryzykiem nawrotu i progresji choroby. Stwierdzono, że zarówno monosomia chromosomu 9 (utrata jednego chromosomu 9), jak i polisomia chromosomów 7 i 17 (więcej niż dwa chromosomy 7 i 17) są związane z nawrotami guzów pęcherza moczowego [13-18]. Watters i wsp. w 2000 roku ocenili wartość prognostyczną polisomii chromosomów 7 i 17 w przewidywaniu nawrotów powierzchownego raka pęcherza moczowego. Stwierdzili, że relatywne ryzyko nawrotów było ponad 3,5-krotnie większe dla pacjentów, u których zaobserwowano polisomię 7 i 17 w pierwotnych guzach w porównaniu do tych, u których tej aberracji nie było [16]. Bartlett i wsp. w 1999 roku obserwowali, że polisomia chromosomów 7 i 17 występuje w ponad 80% raków nawrotowych, zwykle jednocześnie, i jest też często związana z innymi zaburzeniami chromosomowymi [17]. Polisomię chromosomu 9 obserwowano w późnych etapach karcynogenezy, związanych z wysokim stopniem zaawansowania klinicznego i złośliwości histologicznej nowotworu [15,19].
W ponad 50% przypadków raka pęcherza moczowego stwierdza się delecje chromosomu 9 [20-21]. Jest to najczęstsza aberracja obserwowana zarówno w powierzchownych, jak i w inwazyjnych nowotworach pęcherza moczowego. Delecje chromosomu 9 są aberracją obserwowaną w znacznym odsetku przypadków powierzchownych raków brodawczakowatych o niskim stopniu złośliwości histologicznej. Dlatego uważa się, że chromosom 9 zawiera loci dla genów supresorowych, których unieczynnienie jest jednym z wydarzeń inicjujących powstawanie raka pęcherza moczowego. W obrębie chromosomu 9 zlokalizowane są cztery regiony zawierające prawdopodobne loci dla genów supresorowych: 9p21, 9q12-22, 9q32-33 i 9q34 [21]. Najlepiej poznane są geny w locus 9p21 (CDKN2A/ARF) i 9q32-33 (locus genu DBCCR1, ang. deleted in bladder cancer chromosome region candidate 1) [21-23].
Test UroVysion
W 1998 roku grupa badaczy podjęła próbę stworzenia testu diagnostycznego, umożliwiającego skuteczne wykrywanie komórek raka pęcherza moczowego w preparatach z osadu moczu. Posłużono się wielobarwną techniką FISH (ang. Fluorescence In Situ Hybridization). W technice FISH wykorzystuje się syntetyczne jednoniciowe łańcuchy polinukleotydowe, których sekwencja nukleotydowa jest komplementarna do specyficznych sekwencji nukleotydowych, znajdujących się w określonym miejscu chromosomu. Polinukleotydy są wyznakowane fluorescencyjnie i stanowią sondę do hybrydyzacji in situ badanych komórek. Uzyskane sygnały fluorescencyjne są widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wyróżnia się sondy centromerowe, sondy unikalne i malujące. Sondy centromerowe są swoiste dla regionów centromerowych określonych chromosomów, sondy unikalne dla określonych sekwencji DNA w obrębie ramion danego chromosomu, a sondy malujące - dla całego chromosomu. Technika FISH umożliwia identyfikację aberracji chromosomowych zarówno w komórkach dzielących się (w chromosomach metafazalnych), jak i w jądrach komórek niebędących w trakcie podziału (tzw. jądrach interfazowych).
Sokolova i wsp. w 2000 roku użyli sond centromerowych (CEP - ang. Chromosome Enumeration Probes) dla chromosomów 3, 7, 8, 9, 11, 15, 17, 18 i Y oraz sondy dla locus 9p21 (LSI - ang. Locus Specific Indicator/Identifier). Wyboru tych właśnie sond dokonano na podstawie doniesień, że aberracje liczbowe wyżej wymienionych chromosomów i delecje w obrębie tego locus genowego są najczęstszymi zmianami obserwowanymi w przypadku raka urotelialnego. Stwierdzono, że najlepszym zestawem do przeprowadzania badań diagnostycznych są trzy sondy centromerowe CEP3, CEP7 i CEP17 i sonda dla locus 9p21. Cztery wymienione sondy - CEP3 (Spectrum Red), CEP7 (Spectrum Green) i CEP17 (Spectrum Aqua) oraz sonda unikalna LSI dla locus 9p21 (Spectrum Yellow) stanowią mieszaninę sond molekularnych testu UroVysion [24]. Przy użyciu tych sond ocenia się aneuploidię chromosomów 3, 7 i 17 oraz delecję w locus 9p21.
Od roku 2000 kilka grup badaczy oceniło przydatność testu UroVysion do diagnozowania raka pęcherza moczowego. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w tabeli I.
Wykonanie i analiza wyników testu UroVysion
Test UroVysion jest badaniem wykorzystującym technikę FISH w celu analizy aberracji chromosomowych w jądrach interfazowych komórek w preparacie cytologicznym z osadu moczu. Test UroVysion nie może być wykonany w preparatach cytologicznych, których komórki uległy zniszczeniu z powodu złego przechowywania moczu, na których nie ma dostatecznej liczby komórek, na których obecne są liczne bakterie lub/i komórki odczynu zapalnego. Dlatego, w celu uniknięcia wymienionych problemów, preparat cytologiczny do testu UroVysion należy wykonywać w przypadku pacjentów z prawidłowymi wynikami badania ogólnego moczu, najlepiej z drugiego lub trzeciego moczu w ciągu doby. Do wykonania testu UroVysion najczęściej wystarcza od 200 do 250 ml moczu. W nielicznych przypadkach (zwykle u mężczyzn) potrzebna jest większa objętość moczu do badania.
Po wykonaniu preparatów cytologicznych i wstępnym ich przygotowaniu dla potrzeb procesu hybrydyzacji, na każdy preparat nakłada się mieszaninę sond molekularnych testu UroVysion. W celu wizualizacji jąder komórkowych stosuje się barwienie DAPI. Analizę preparatów przeprowadza się w dwóch etapach. Każde badanie rozpoczyna ocena morfologii komórek w preparacie z osadu moczu, przy użyciu jednopasmowego filtru optycznego DAPI. Wybiera się dwadzieścia pięć komórek z dużymi jądrami komórkowymi i/lub innymi nieprawidłowościami morfologicznymi (ryc. 1).
W wybranych komórkach ocenia się następnie liczbę sygnałów pochodzących z fluorochromów sond molekularnych, używając kolejno filtrów optycznych: Red, Green, Aqua i Yellow (ryc. 2-3). W przypadkach, gdy komórki w preparacie są dobrze zróżnicowane, analizy dokonuje się w stu komórkach.
Istnieją dwa kryteria, na podstawie których można uznać wynik testu UroVysion za pozytywny:
- kryterium "n1" - gdy w minimum dwunastu komórkach na dwadzieścia pięć lub w czterdziestu ośmiu komórkach na sto badanych (48%) stwierdza się utratę obydwu alleli w locus 9p21 (brak sygnału żółtego).
- kryterium "n2" - gdy występuje polisomia minimum dwóch spośród trzech chromosomów, badanych za pomocą sond centromerowych - CEP3, CEP7, CEP17 w minimum czterech komórkach na dwadzieścia pięć lub szesnaście na sto badanych (16%). Obserwuje się wtedy więcej niż dwa sygnały pochodzące z fluorochromów sond centromerowych dla przynajmniej dwóch chromosomów:
>2 sygnały red (CEP3) i green (CEP7) lub
>2 sygnały red (CEP3) i aqua (CEP17) lub
>2 sygnały green (CEP7) i aqua (CEP17).
Podsumowanie kryteriów, na podstawie których należy uznać wynik za pozytywny, przedstawiono w tabeli II.
Porównanie testu UroVysion i badania cytologicznego z osadu moczu
Najczęściej stosowanym nieinwazyjnym badaniem przy diagnozowaniu pierwotnych i nawrotowych raków pęcherza moczowego jest cytologia osadu moczu. Badanie cytologiczne, mimo swojej wysokiej swoistości (średnio około 94%), charakteryzuje się niską czułością (średnio około 55%) [4], szczególnie w przypadkach guzów powierzchownych (pTa-pT1) o niskim stopniu złośliwości histologicznej (G1) [31]. W celu oceny przydatności testu UroVysion do pierwotnego i wtórnego diagnozowania raka pęcherza moczowego dwóch badaczy Bubendorf i Placer wraz ze wsp. dokonali porównania czułości obu wyżej wymienionych testów [25,26]. W tabeli III przedstawiono wyniki tych badań.
Bubendorf i wsp. (2001) oraz Placer i wsp. (2002) wykazali, że test UroVysion ma zdecydowanie wyższą czułość niż badanie cytologiczne z osadu moczu dla wszystkich stadiów zaawansowania klinicznego, a także stopni złośliwości histologicznej guzów pęcherza moczowego. Autorzy ci stwierdzili, że przy użyciu testu UroVysion można wykryć 100% guzów inwazyjnych pęcherza moczowego (pT2-T4). Inwazyjny rak pęcherza moczowego może więc być właściwie wykluczony w przypadku ujemnego wyniku testu UroVysion. Również guzy pT1 naciekające tylko błonę podśluzową, które zaliczane są do raków powierzchownych, były przez autorów wykrywane ze stuprocentową czułością [25,26].
Bubendorf i Placer nie porównywali swoistości testu UroVysion i cytologii. Jednak z badań innych autorów wiadomo, że swoistość testu UroVysion wynosi około 95% [25-30] i jest porównywalna ze swoistością badania cytologicznego osadu moczu (średnio około 94% [4]).
Miejsce testu UroVysion w diagnozowaniu raka pęcherza moczowego
W wieloośrodkowym badaniu porównano czułość cystoskopii, cytologii i testu UroVysion i połączenia tych metod w diagnozowaniu raka pęcherza moczowego [31,32]. Poddano badaniom dwustu sześćdziesięciu pięciu pacjentów, w tym stu pięćdziesięciu monitorowanych po leczeniu z powodu raka pęcherza moczowego i stu piętnastu w trakcie pierwotnej diagnozy w tym kierunku. U siedemdziesięciu pięciu chorych potwierdzono w badaniu histopatologicznym raka pęcherza moczowego.
W analizowanym materiale czułość testu UroVysion wyniosła 81% (59/73). Pozytywny wynik badania cystoskopowego uzyskano w pięćdziesięciu czterech na siedemdziesiąt trzy badane przypadki (tzn. uzyskano czułość 74%), dodatkowo w dwunastu wynik był niejednoznaczy, ale potwierdzono raka histopatologicznie. We wszystkich tych przypadkach wynik testu UroVysion był pozytywny. Cytologię z osadu moczu wykonano u sześćdziesięciu dziewięciu z siedemdziesięciu pięciu analizowanych pacjentów. U trzydziestu trzech chorych wynik badania cytologicznego był pozytywny, u dwudziestu dziewięciu negatywny i u siedmiu niejednoznaczny. Uwzględniając wyniki niejednoznaczne, czułość cytologii oceniono na 58% (40/69). Test UroVysion był pozytywny w sześciu na siedem przypadków z niejednoznacznym wynikiem badania cytologicznego z osadu moczu [31]. Powyższe wyniki wskazują więc na szczególną przydatność testu UroVysion, gdy wynik badania cystoskopowego i/lub cytologicznego jest niejednoznaczny.
Autorzy ocenili oddzielnie czułość cystoskopii, cytologii i testu UroVysion i łącznie cystoskopii razem z cytologią oraz cystoskopii z testem UroVysion, wykazując, że optymalną czułością (98%) charakteryzują się wykonywane łącznie badanie cystoskopowe i test UroVysion. Dla porównania czułość badania cystoskopowego poprzedzonego cytologią osadu moczu wyniosła 88% (tab. IV).
Pozytywny wynik testu UroVysion a ryzyko wznowy raka pęcherza moczowego
U 60-70% pacjentów z powierzchownym rakiem pęcherza moczowego dochodzi do nawrotu po przezcewkowej resekcji guza. Dlatego monitorowanie pacjentów po pierwotnej diagnostyce i leczeniu oraz wczesne wykrywanie ewentualnych nawrotów choroby nowotworowej jest istotną częścią opieki lekarskiej nad chorym na raka pęcherza moczowego.
Takahashi i wsp. w 2002 r. zbadali grupę stu sześćdziesięciu sześciu pacjentów monitorowanych z powodu raka pęcherza moczowego, u których w kontrolnej cystoskopii nie stwierdzono wznowy guza [33]. U wszystkich pacjentów wykonano test UroVysion. Autorzy przyjęli za kryterium wyniku pozytywnego obecność polisomii minimum dwóch badanych chromosomów w pięciu na dwudziestu pięciu analizowanych, zmienionych morfologicznie komórek i uzyskali czterdzieści pięć wyników pozytywnych testu UroVysion oraz sto dwadzieścia jeden wyników negatywnych. W czasie dalszego monitorowania tej grupy chorych stwierdzono wznowę raka pęcherza moczowego u szesnastu z czterdziestu pięciu pacjentów (35,6%), u których uzyskano wynik UroVysion (+) oraz u osiemnastu ze stu dwudziestu jeden pacjentów (14,9%), u których wynik testu UroVysion był negatywny. Odsetek nawrotów w tych dwóch grupach chorych odpowiednio w ciągu roku i dwóch lat przedstawiono w tabeli V.
Takahashi i wsp. (2002) stwierdzili, że wśród obserwowanych pacjentów chorzy, u których - mimo braku guza w badaniu cystoskopowym - wynik testu UroVysion był pozytywny, mieli 3,5-krotnie wyższe ryzyko wystąpienia wznowy w porównaniu z pacjentami z negatywnym wynikiem UroVysion.
Autorzy przeanalizowali również ryzyko wystąpienia wznowy high grade/high stage w zależności od wyniku testu UroVysion (z analizy wykluczyli guzy nawrotowe pTa G1-G2). Odsetek nawrotów guzów high grade/high stage w tych dwóch grupach chorych odpowiednio w ciągu roku i dwóch lat przedstawia tabela VI.
Pacjenci, u których autorzy uzyskali pozytywny wynik testu UroVysion, mieli 6,4-krotnie wyższe ryzyko nawrotu high grade/high stage w porównaniu z pacjentami z UroVysion negatywnym.
Podsumowując, wyniki Takahashi i wsp. 2002 wskazują, że test UroVysion jest przydatny w przewidywaniu wystąpienia nawrotów u pacjentów monitorowanych po pierwotnej resekcji guza pęcherza moczowego. Szczególnie pomocny jest test UroVysion w prognozowaniu nawrotów guzów high grade/high stage.
Przydatność testu UroVysion u chorych leczonych wlewkami BCG
W czasie stosowania dopęcherzowej immunoterapii szczepionką BCG dochodzi do powstania zmian morfologii komórek nabłonka przejściowego. Terapia BCG powoduje pojawienie się w moczu większej liczby komórek odczynu zapalnego, w komórkach nabłonka urotelialnego dochodzi do zmian morfologicznych dotyczących jądra komórkowego i cytoplazmy [34]. Prawidłowa ocena preparatów cytologicznych z osadu moczu pacjentów poddanych miejscowej immunoterapii jest więc szczególnie trudna.
Karnes i wsp. w 2003 roku stwierdzili, że w przeciwieństwie do badania cytologicznego, terapia BCG i zmiany odczynowe jej towarzyszące nie wpływają na interpretację wyniku testu UroVysion. Według tych autorów test UroVysion jest jedynym badaniem dającym wiarygodne rezultaty w czasie monitorowania pacjentów poddawanych terapii BCG. Dlatego technika FISH może być szczególnie przydatna do diagnozowania nawrotów i/lub niecałkowitego wycięcia guza u chorych leczonych dopęcherzowymi wlewkami BCG [35].
Aberracje chromosomowe a długość okresu wolnego od nawrotu choroby
Krüger i wsp. (2003 r.) w jednym z ostatnich badań dotyczących zastosowania testu UroVysion wykazali związek między aberracjami chromosomowymi obserwowanymi w jądrach komórek guza a długością okresu wolnego od nawrotu choroby nowotworowej pęcherza moczowego [36]. Autorzy analizowali preparaty histopatologiczne od siedemdziesięciu jeden pacjentów, u których stwierdzono guzy pierwotne w stadium zaawansowania klinicznego pTa. Autorzy wykazali, że pentasomia lub wyższa polisomia chromosomu 17 oraz homozygotyczna delecja w locus 9p21 stanowią niezależne czynniki prognostyczne w ocenie ryzyka nawrotu guza.
Podsumowanie
Liczne badania potwierdzają wysoką czułość testu UroVysion przy diagnozowaniu pierwotnych i nawrotowych raków pęcherza moczowego. Wielu badaczy wykazało, że test UroVysion charakteryzuje się zdecydowanie wyższą czułością niż badanie cytologiczne z osadu moczu we wszystkich stadiach zaawansowania klinicznego i stopniach złośliwości histologicznej guzów pęcherza moczowego. Test ten pozwala na wykrycie blisko 100% raków inwazyjnych. Dlatego można praktycznie wykluczyć obecność guza inwazyjnego, jeśli wynik testu UroVysion jest negatywny. Według danych literaturowych test ten charakteryzuje się również wysoką swoistością (około 95%), porównywalną ze swoistością badania cytologicznego z osadu moczu (około 94%).
Własne czteroletnie doświadczenie w wykonywaniu testu UroVysion pozwala nam dołączyć się do pozytywnych opinii na temat zastosowania wyżej wymienionego badania w diagnozowaniu pierwotnych i wtórnych raków pęcherza moczowego. We wstępnych badaniach własnych (dane niepublikowane) uzyskaliśmy czułość testu UroVysion 96% (50/52) dla guzów pierwotnych i 87,5% (14/16) dla guzów nawrotowych. W badaniach tych uzyskaliśmy również czułość testu UroVysion dla guzów pT2-T4 równą 100% (21/21), co potwierdza obserwacje Bubendorfa i Placera, że ujemny wynik testu UroVysion pozwala właściwie na wykluczenie obecności inwazyjnego guza pęcherza moczowego. Dla guzów pT1 czułość badania była również wysoka - test UroVysion pozwolił nam na wykrycie szesnastu z siedemnastu przypadków raków, których naciek dotyczył tylko błony śluzowej (94%). Po wstępnych badaniach w chwili obecnej prowadzimy badania diagnostyczne wśród chorych monitorowanych w kierunku nawrotu raka pęcherza moczowego. Wyniki tych badań wymagają jeszcze dalszej obserwacji i analizowania dalszego przebiegu choroby u badanych pacjentów.
Doświadczenia własne oraz innych badaczy pozwalają stwierdzić, że test UroVysion jest skutecznym narzędziem diagnostycznym u chorych na raka pęcherza moczowego. Szczególnie przydatny jest w przypadkach monitorowania pacjentów, u których istnieje wysokie ryzyko nawrotu guza (guzy pierwotne G2 - G3), pacjentów poddanych leczeniu dopęcherzowymi wlewkami BCG oraz pacjentów, u których wyniki standardowych badań są niejednoznaczne. W czasie monitorowania nawrotów raka w przypadku wyraźnie ujemnego wyniku testu UroVysion lekarz prowadzący może podjąć decyzję o przesunięciu na dalszy termin kontrolnego badania cystoskopowego. Takie postępowanie może ograniczyć liczbę koniecznych badań cystoskopowych, które wymagają hospitalizacji chorego, są badaniami inwazyjnymi i wiążą się z dyskomfortem pacjenta.
Obok wartości testu UroVysion, jako badania uzupełniającego w diagnozowaniu chorych na raka pęcherza moczowego, warto podkreślić potencjalne informacje prognostyczne, które można uzyskać analizując spektrum aberracji chromosomowych w komórkach guza. Wyniki ostatnich badań wskazują, że poza uznanymi czynnikami prognostycznymi w przypadkach raka pęcherza moczowego (stadium zaawansowania klinicznego [stage], stopień złośliwości histologicznej [grade], wielkość guzów i ich liczba) również pentasomia lub wyższa polisomia chromosomu 17 oraz homozygotyczna delecja w locus 9p21 mogą umożliwić określenie indywidualnej prognozy u pacjenta.