english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Zasada fluorescencji i mikroskopia fluorescencyjna

Związki chemiczne absorbują promieniowanie o określonej energii, a następnie wypromieniowują falę o zmienionej energii. Zjawisko to w optyce opisywane jest jako widma absorbancji i emisji. Widma te charakteryzują się różnymi wartościami energetycznymi i dlatego mogą być widoczne „gołym okiem” lub dzięki użyciu detektora. Związek chemiczny jest fluorochromem, czyli fluoryzuje, jeżeli zawiera zdolność absorbowania fali o określonej długości w zakresie promieniowania ultrafioletowego (wzbudzenie, absorbancja) i emituje światło o mniejszej energii w zakresie widma widzialnego (emisja). Emisja ta jest widzialna i może być obserwowana pod mikroskopem. Energie emisji fluorochromów mają różną wartość i dlatego widoczne promieniowanie posiada barwy od niebieskiej i zielonej po ciemnoczerwoną. Technika badawcza, w której używa się związków fluorescencyjnych do zabarwiania struktur komórkowych do ich obserwacji w mikroskopie, nazywa się mikroskopią fluorescencyjną. Do wizualizacji używane jest tylko światło emisji. Światło wzbudzania (absorbancji) blokowane jest przez filtry znajdujące się w mikroskopie.

Badanie w mikroskopie fluorescencyjnym polega na tym, iż wyłączone zostaje światło widzialne, a preparat jest oświetlany w ciemnym polu widzenia przez promienie UV. Jeżeli fluorochrom zwiąże się ze strukturą komórki, np. chromatyną jądrową, to zacznie po pewnym czasie emitować światło o kolorze dla niego charakterystycznym (np. jodek propidyny na czerwono) i będzie możliwa obserwacja tylko jąder komórkowych świecących kolorem czerwonym, podczas gdy inne części komórek w ogóle nie będą widoczne [1].

Od badań cytogenetycznych do hybrydyzacji in situ

Badania molekularne w medycynie z wielu przyczyn są skomplikowane. Jedną z nich jest rozmiar badanego obiektu, którym w tym przypadku jest cząsteczka DNA. Inne fizyczne metody badania DNA są wyjątkowo trudne i wnoszą bardzo mało informacji, poza tą, że DNA znajduje się w komórce. Mikroskop wykorzystujący optykę fal świetlnych pozwala obserwować DNA tylko w formie skondensowanej, tj. w postaci chromosomów metafazalnych. Obserwacja mikroskopowa w świetle widzialnym po tradycyjnym wybarwieniu prążków ograniczona jest długością fali, która pozwala na oglądanie DNA w postaci skondensowanej (chromosomy metafazowe) lub ciałka Barra w jądrze komórkowym organizmów posiadających żeński genotyp.

Obserwacja skondensowanej formy DNA stosowana jest szeroko w badaniach cytogenetycznych; dzięki nim można stwierdzić zmiany w dużych obszarach chromosomów obejmujące kilkadziesiąt czy też kilkaset genów. Ta rozdzielczość nie może zadowalać i być podstawą nowoczesnej diagnostyki. Zastosowanie mikroskopu elektronowego o większej rozdzielczości, w którym do obrazowania używana jest wiązka elektronów, również nie przynosi zadowalającego rozwiązania. Mikroskop elektronowy pozwala jedynie na obserwację nici DNA, nie dając żadnych informacji na temat budowy ani funkcji. Obserwacja struktur kwasów nukleinowych w mikroskopie elektronowym nie wnosi istotnych danych o ich uszkodzeniach.

Niewielkie zmiany w budowie nici DNA (np. zamiana jednej zasady azotowej na inną) prowadzą do równie poważnych schorzeń, jak choroby spowodowane brakiem kilkuset zasad azotowych lub utraty wielu genów. Jeżeli zmiany w strukturze DNA są niewielkie i dotyczą jednego bądź kilkunastu nukleotydów i nie mogą być uwidocznione podczas typowych badań cytogenetycznych, wówczas stosuje się metodę hybrydyzacji in situ. Metoda hybrydyzacji in situ pozwala prześledzić i zlokalizować nawet niewielkie zmiany w strukturze DNA, które mogą być odpowiedzialne za powstanie wielu chorób dziedzicznych i nabytych, m.in. chorób nowotworowych.

Metoda hybrydyzacji in situ wykorzystuje zasadę komplementarnego (uzupełniającego) łączenia się nici DNA. Cząsteczka DNA jest dwuniciowa. Obie nici DNA uzupełniają się dzięki leżącym naprzeciwko siebie komplementarnym zasadom azotowym. Nici te po rozdzieleniu odpowiednim enzymem, np. gyrazą, łączą się ponownie, tworząc tę samą dwuniciową strukturę DNA (zasada komplementarności Chargaffa). Właściwości komplementarnego łączenia się nici DNA wykorzystano do budowy sond molekularnych. Sonda molekularna jest odcinkiem DNA, zsyntetyzowanym in vitro jako komplementarny odcinek do odcinka DNA, który ma być zbadany lub jest poszukiwany. Sonda taka odnajduje komplementarny odcinek i łączy się z nim. Na obserwację połączenia się sondy molekularnej z odpowiadającym jej odcinkiem DNA nie pozwala ani mikroskopia optyczna, ani elektronowa, jeżeli stosowane są jako jedyne metody obrazowania. Do tego typu obserwacji konieczne jest zastosowanie łącznie dwóch metod badawczych, a mianowicie hybrydyzacji in situ oraz np. mikroskopii fluorescencyjnej [2,3].

Mikroskopia fluorescencyjna + hybrydyzacja in situ = FISH

Opracowano metodę badawczą, która łączy techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta nazywa się fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH – Fluorescent In Situ Hybrydisation). W metodzie FISH fluorochrom związany jest z przygotowaną w laboratorium sondą DNA, która „rozpoznaje” i łączy się z badanym DNA komórkowym in situ, czyli w komórce. Sonda DNA (marker) przyłącza się do DNA osoby badanej a w mikroskopie fluorescencyjnym będzie emitowane światło widzialne w kolorze charakterystycznym dla energii emisji użytego fluorochromu (marker sondy). Miejsce połączenia sondy będzie widoczne jako intensywnie świecący jasny punkt w ciemnym polu widzenia mikroskopu. Istnieje wiele odmian i sposobów aplikacji techniki FISH. Technika FISH pozwala na uzyskanie różnych obrazów i dzięki rozdzielczości mikroskopu optycznego daje możliwości mapowania fizycznego (morfologicznego) genomu. FISH jest techniką wszechstronnej analizy genomowego DNA. Technika FISH służy do poszukiwania zmian liczbowych lub strukturalnych chromosomów (analiza cytogenetyczna), ale również do analizy molekularnej. FISH jest także metodą służącą do poszukiwania pojedynczych genów w chromosomie. Metodą FISH można wybarwić pojedyncze chromosomy lub tylko ich odcinki w poszukiwaniu obszarów mikrodelecji. W metodzie zwanej telomerowy/subtelomerowy FISH zabarwiane są tylko odcinki dystalne chromosomów (telomery). Metoda ta służy do badania stabilności genomu. Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH – Comparative Genomic Hybrydisation) pozwala na mapowanie sekwencji genomowych bez uprzedniej wiedzy o ich istnieniu i umiejscowieniu. Hybrydyzacji ulega wyznakowany DNA badany z wyznakowaną sondą fluorescencyjną DNA referencyjnym. Detekcja dwubarwnej fluorescencji zhybrydyzowanego DNA badanego zabarwionego na zielono biotyną z prawidłowym, referencyjnym zabarwionym na czerwono digoksygeniną, poddana jest ilościowej analizie stosunku sygnałów. Wartości większe lub mniejsze od 1 świadczą o zwiększeniu lub zmniejszeniu kopii sekwencji badanego DNA w stosunku do prawidłowego (referencyjnego), DNA.

Do diagnostyki DNA metodą FISH pobiera się najczęściej limfocyty krwi obwodowej, utrwalone preparaty tkankowe lub komórki osadu moczu, w których analizuje się DNA w okresie międzypodziałowym komórki (Interfazalny FISH, I-FISH). Do badań DNA w technice FISH używa się również komórek z hodowli in vitro, zatrzymanych w metafazie cyklu komórkowego (limfocyty, fibroblasty lub inne komórki). Jeżeli ocenie jest poddawany DNA w postaci skondensowanej, np. chromosomów metafazalnych, to wynik badania FISH charakteryzuje się niską rozdzielczością, ale łatwo można przypisać położenie sondy do konkretnego chromosomu. Jeśli analizowane DNA jest rozpętlone (I-FISH), wówczas rozdzielczość w przypadku obecności zmian leżących blisko siebie na nici DNA jest duża, ale trudno jest przyporządkować położenie sondy konkretnemu chromosomowi [2,3].

Zastosowania metody FISH w diagnostyce raka pęcherza moczowego (TCC)

Zmianami genomu najlepiej charakteryzującymi komórki raka wywodzącego się z komórek przejściowych (TCC – Transitional Cell Carcinoma) są dodatkowe chromosomy 3,7 i 17 oraz delecja regionu 9p21. Ze względu na łatwą dostępność materiału (komórki osadu moczu) udało się przygotować „prosty” test (UroVysion Test) w oparciu o zasadę FISH, który rozpoznaje dodatkowe kopie chromosomów 3,7,17 oraz delecję 9p21. Analizując te aberracje za pomocą testu UroVysion u dwudziestu jeden pacjentów uzyskano 84,2% czułość oraz 91,8% specyficzność metody wykrywania raka pęcherza moczowego (TCC) [4]. Halling i wsp. u 265 pacjentów analizowali metodą FISH aberracje liczbowe 3,7 i 17 chromosomu oraz delecję regionu 9p21. Autorzy ci wykazali, iż metoda FISH w porównaniu z badaniem cytologicznym osadu moczu charakteryzuje się wyższą czułością oraz porównywalną specyficznością [5]. Wykazali oni jednocześnie u tych samych chorych, że test BTAstat oraz obecność krwi w moczu charakteryzują się gorszą specyficznością w porównaniu do UroVysion Test [6]. Kipp i wsp. przygotowali specjalny zestaw do pobierania komórek do analizy FISH (ThinPrep UroCyte filters). Metoda ta znacznie skraca czas przygotowania komórek do analizy z 194 do 103 minut [7].

Zestawienie nieinwazyjnych metod wykrywania raka pęcherza moczowego wskazuje, iż test UroVysion charakteryzuje się bardzo dużą czułością i specyficznością [8]. Test UroVysion był dodatni w 100% w grupie trzydziestu siedmiu chorych na nawrotowego raka pęcherza, u których zastosowano wlewki z mitomycyny C lub BCG. Leczenie dopęcherzowe nie wpłynęło na wyniki testu UroVysion. Przy okazji tego badania zauważono, iż pacjenci z dodatnim wynikiem testu UroVysion są w grupie ryzyka progresji do raka naciekającego mięśniówkę pęcherza moczowego [9]. Raki pT1-G3 często wykazują w teście UroVision takie same zmiany chromosomalne, jak raki oceniane jako pT2-G3 i pT3-G3 i być może dlatego powinny być leczone tak, jak raki inwazyjne, naciekające mięśniówkę (pT2). W przypadku raków pęcherza moczowego, klasyfikowanych jako pTa,G1-G2 oraz pT1,G1-G2, które wykazują brak wznowy w okresie obserwacji po leczeniu endoskopowym, a w analizie FISH komórek osadu moczu występują charakterystyczne zaburzenia genomu, powinno wykonać się biopsję randomową (mapping) pęcherza moczowego [10].

Największą wadą nieinwazyjnych testów wykrywających raka pęcherza moczowego jest ich niska czułość. Analiza FISH jest obecnie najbardziej czułym testem dostępnym na rynku, wykrywającym raka pęcherza moczowego we wszystkich stopniach zaawansowania (pTa-pT4) (tab. I) [10].

Dzięki testowi UroVysion stało się możliwe wyodrębnienie pacjentów zaliczanych do grupy średniego ryzyka nawrotu i progresji powierzchownego raka pęcherza moczowego. Klasyfikując pacjentów na podstawie zmian DNA można ich przyporządkować do grupy niskiego ryzyka i monitorować w sposób odpowiedni dla tej grupy lub do grupy wysokiego ryzyka nawrotu i progresji raka, stosując odpowiedni dla tej grupy schemat obserwacji i leczenia [11]. Stosowanie testu UroVysion pozwala przewidzieć nawrót raka w grupie średniego ryzyka. Test UroVysion wydaje się godny polecenia jako nieinwazyjna metoda monitorowania powierzchownych raków pęcherza moczowego, szczególnie o wysokiej złośliwości (G-3). Dodatni UroVysion test przy braku cech i objawów nawrotowego raka pęcherza moczowego świadczyć może o obecności raka miedniczki nerkowej, moczowodu, cewki moczowej lub raka stercza [10].

Zastosowania metody FISH w diagnostyce raka stercza

Kopiowanie materiału genetycznego jest ściśle zaprogramowanym procesem, skorelowanym z ekspresją genów, stabilnością genomu oraz procesem metylacji DNA. Udowodniono, że proces nowotworzenia zachodzi podczas replikacji DNA i nawet prawidłowe komórki pacjentów cierpiących na choroby nowotworowe charakteryzują się zaburzeniami replikacji materiału genetycznego. Dzięki testowi oceniającemu zaburzenia replikacji w limfocytach krwi obwodowej możliwe będzie prawdopodobnie odróżnienie chorych na łagodny przerost stercza od chorych na raka stercza [12]. Wykazano natomiast, iż gen DD3(PCA3) jest wysoce specyficzny dla raka stercza. Produkt genu DD3(PCA3) jest wykrywany techniką FISH w komórkach raka stercza otrzymanych z masażu stercza. Badanie określające łącznie obecność produktu genu DD3 oraz analizujące poziom białka PSA (uPM3 Test) wykazało bardzo wysoką czułość, specyficzność oraz dodatnią i ujemną wartość przepowiadającą 82%, 76%, 67% i 87% w porównaniu z samym poziomem całkowitym PSA, gdzie wartości te wynosiły 98%, 5%, 40% i 83% przy odcięciu granicznej wartości PSA na poziomie 2,5 ng/ml. Test uPM3 wykazuje o wiele lepsze właściwości i specyficzność od badania samego PSA [13].

Analiza FISH komórek raka stercza wykazała zaburzenia chromosomowe o charakterze aneuploidii dotyczących chromosomów 7, 8, 11, 13, 17, 18 oraz X. Duplikacja rejonu 8q24, 11q13 oraz utrata chromosomu 7 są związane z rakami charakteryzującymi się wysokim stopniem złośliwości i sumy zliczanej według Gleasona. Trisomia chromosomu 7 była częsta w raku stercza zaawansowanym miejscowo, podczas gdy duplikacja 11q13 stwierdzana jest w ogniskach przerzutowego raka stercza [14,15]. Nie znaleziono do tej pory aberracji chromosomowych, które są odpowiedzalne za przekształcenie śródnabłonkowej neoplazji w sterczu (PIN) w raka stercza [16].

Badanie przeprowadzone za pomocą techniki FISH przez Alcaraza i wsp. wykazało, iż komórki guza pierwotnego oraz przerzutów raka stercza charakteryzują się podobnymi zmianami takimi, jak obecność trzech chromosomów 7 oraz jednego 8. Badania te sugerują, że klonalna selekcja nie ma wpływu na powstawanie i rozwój raka stercza [17]. Brown i wsp. wykazali, posługując się analizą FISH, iż amplifikacja receptora androgenowego wiąże się z hormonoopornością raka stercza, a może nawet do niej prowadzi [15]. Uważa się, że niestabilność genomu komórki związana jest z obniżoną zdolnością odpowiedzi na leczenie antyandrogenami oraz progresywny charakter choroby [18]. W badaniach przeprowadzonych przez Ropkego i wsp. wykazano, że dodatkowe kopie genów receptora androgenowego wiążą się z obecnością dodatkowych kopii chromosomu X, który może być wykryty za pomocą analizy FISH. Dzięki analizie FISH możliwe będzie w przyszłości wyodrębnienie grupy chorych obarczonych wysokim ryzykiem wystąpienia wczesnej hormonooporności komórek raka stercza [19].

Zastosowania metody FISH w diagnostyce raka jasnokomórkowego nerki (RCC) oraz guza Wilmsa

Diagnostyka hybrydowych guzów nerek składających się z kilku składników pochodzących z różnych listków zarodkowych lub różnych komórek progenitorowych stanowi wielkie wyzwanie dla patologów. Technika FISH analizy zaburzeń chromosomowych może być niezmiernie przydatna w tej dziedzinie. Dzięki technice FISH możliwe jest odróżnienie onkocytoma od brodawkowatego RCC oraz zlokalizowanie ognisk brodawkowatego RCC, co jest szczególnie istotne dla rokowania u pacjentów z guzem nerki [20]. Odróżnienie podtypów raka jasnokomórkowego nastręcza czasem patologom trudności. Dzięki zmianom w chromosomie 17 interfazalny FISH (I-FISH) pozwala odróżnić podtypy raka nerki oraz daje możliwość analizy guzów zbudowanych z różnych podtypów raka jasnokomórkowego, co wpływa na możliwość rokowania u pacjentów po nefrektomii [21,22]. Sanjmyatav i wsp. wykazali, że metoda FISH nadaje się do szybkiej klasyfikacji podtypów raka nerki. W grupie dwudziestu pięciu chorych na raka nerek dwadzieścia dwa raki oceniono prawidłowo dzięki użyciu techniki FISH [23]. Raki nerki o agresywnym przebiegu klinicznym wykazują zaburzenia aktywności telomerazy. Wysoka aktywność telomerazy warunkuje stabilność genomu komórki. Prawdopodobnie raki nerki wykazujące wysoką aktywność telomerazy charakteryzują się łagodniejszym przebiegiem [24]. Uważa się, iż zaburzenia, u których podstawy leży brak stabilności genomu, są przyczyną heterogenności w budowie histologicznej raków nerek, tak często spotykanej w rozpoznaniach histopatologicznych. Jest to kolejny powód, dla którego diagnostyka przy użyciu FISH jest pomocna przy rozpoznaniu tych różnych komponentów histologicznych raka nerki [25].

Aniridia (brak tęczówki) jest cechą autosomalną dominującą. Za wystąpienie aniridii często odpowiada brak jednego z genów PAX6. Technika FISH używana jest w teście diagnostycznym, który identyfikuje grupę wysokiego ryzyka wśród osób z aniridią, występującą w zespole WARG (Wilms, Aniridia, mental Retardation, Genito-urinary abnormalities), ponieważ gen PAX6 leży w pobliżu genu WT1 odpowiedzialnego za powstanie guza Wilmsa. Diagnostyka opiera się na stwierdzeniu delecji w obrębie regionu PAX6-WT1. Osoby z wyżej wymienioną delecją są wysoce predysponowane do rozwoju guza Wilmsa. W zestawieniu stu dwóch pacjentów z aniridią aż dwudziestu dziewięciu wykazywało delecję w rejonie PAX6-WT1. Wśród pacjentów z delecją u trzynastu (45%) rozwinął się guz Wilmsa. Natomiast z osób bez delecji w regionie PAX6-WT1 guz Wilmsa nie rozwinął się [26,27].

Zastosowania metody FISH w diagnostyce guzów jąder

Niewiele prac dotyczy zastosowania analizy FISH w diagnostyce guzów jąder. Autorzy prac dotyczących ekspresji receptorów dla naskórkowego czynnika wzrostu (EGF – Epidermal Growth Factor) przytaczają sprzeczne wyniki ekspresji tego białka w rakach jąder. Badania za pomocą techniki FISH wykazały, iż na razie nie ma podstaw do leczenia raków jądra przeciwciałami skierowanymi przeciwko EGF [28]. W analizie aberracji chromosomowych występujących w rakach jądra szczególnie przydatna okazała się technika CGH, która następnie potwierdzana była wynikami analizy FISH [29]. Dzięki tej technice można było zdiagnozować zaburzenia genomu występujące w komórkach raka jądra, o których wcześniej nie wiedziano.

Interesujące badanie z wykorzystaniem techniki FISH przedstawione przez Pena-Alonso i wsp. dowodzi, iż rzadko występujące mieszane guzy sznurów płciowych mogą ulec przekształceniu w nasieniaki lub raki. Dotyczy to aż 30% potencjalnych pacjentów z zaburzeniami różnicowania płci i guzami sznurów płciowych (gonadoblastoma), z których powstają dysgerminoma i nasieniaki. Zaburzenia chromosomalne, obserwowane za pomocą techniki FISH w dysgenetycznych gonadach, wskazują i potwierdzają możliwość bardzo wczesnej karcinogenezy i konieczność profilaktycznego usunięcia dysgenetycznych gonad [30].

Zastosowania metody FISH w diagnostyce różnicowania płci i leczeniu niepłodności

Metody wykorzystujące technikę hybrydyzacji sond znakowanych fluorochromami są podstawowymi narzędziami pracy w ocenie zaburzeń różnicowania płci i leczenia niepłodności oraz stanowią uzupełnienie konwencjonalnej diagnostyki cytogenetycznej [31].

Technika FISH wydaje się przydatna w analizie komórek nasienia do diagnostyki niepłodności. Dzięki tym badaniom analizować można zaburzenia podziałów mejotycznych, których nie nie można wykryć przy pomocy zwykłej analizy kariotypu [32]. Technika FISH jest często używana do oceny zaburzeń liczbowych chromosomów w komórkach ejakulatu i blastomerach jako element poradnictwa przed wykonaniem zabiegów zapłodnia in vitro. Metoda oceny materiału genetycznego użytego w technice zapłodnienia in vitro pozwala zmniejszyć liczbę niepowodzeń leczenia tą metodą. Jest to ważne szczególnie w przypadkach niepłodności związanej z czynnikiem męskim oraz o bardzo złym rokowaniu [33]. Sun i wsp. na podstawie badań

z użyciem techniki FISH zasugerowali, iż istnieje związek między morfologią plemników a rodzajem zaburzeń chromosomowych. Zaburzenia o charakterze aneuploidii, które często związane są z licznymi niepowodzeniami techniki sztucznego zapłodnienia występują bardzo często w przypadkach stwierdzonej teratozoospermii. Badacze sugerują związek między morfologią nasienia i aneuploidią u niepłodnych mężczyzn [34].

Wnioski

1. Metoda oceny komórek techniką FISH znajdzie zapewne zastosowanie w diagnostyce raka pęcherza moczowego, raka stercza oraz prawdopodobnie guza Wilmsa. Technika FISH może być również wykorzystywana w diagnostyce histologicznej guzów nerek zbudowanych z wielu komponentów.
2. Technika FISH wykorzystywana jest obecnie szeroko w badaniach eksperymentalnych oraz w diagnostyce cytogenetycznej zaburzeń płodności.
3. Metoda FISH jest czasochłonna, wymaga przygotowania preparatu komórek, a niejednokrotnie nawet uzyskania komórek z hodowli in vitro. Czas wykonania badania jest długi, wysokie zaś ceny są kolejnymi przeszkodami na drodze do wprowadzenia tej techniki. Te niedogodności powodują, że proces wprowadzenia metody FISH do codziennej praktyki klinicznej przebiega bardzo powoli.

Słowniczek

Aberracje liczbowe i strukturalne chromosomów – zmiany liczby i budowy chromosomów.

Aneuploidia – zmiany liczby chromosomów dotyczące pojedynczych par chromosomów takie, iż nie prowadzą one do powielenia kompletu chromosomów o liczbę całkowitą. Najczęściej występujące aneuploidie polegają na obecności jednego dodatkowego chromosomu lub na braku chromosomu w parze.

Chromosom metafazowy – chromosom, w którym DNA występuje w najbardziej skondensowanej formie, chromosom taki jest dobrze widoczny w mikroskopie optycznym.

Delecja – mutacja polegająca na utracie materiału genetycznego.

Duplikacja – mutacja polegająca na obecności dodatkowej kopii genu, segmentu bądź całego chromosomu.

Genom – w najszerszym znaczeniu: całkowity DNA w jądrze komórkowym.

Interfaza – okres między podziałami w cyklu życia komórki; chromosomy są rozpętlone i nie mogą być zidentyfikowane jako osobne struktury.

Metafaza – jedna z faz w okresie podziału komórki; w metafazie chromosomy są skondensowane.

Telomeraza – enzym biorący udział w formowaniu i stabilizacji końcowych odcinków chromosomów; działanie telomerazy wiąże się z stabilnością informacji genetycznej.

1. Drewa T: Wpływ nowych kompleksów platyny na przeżywalność i apoptozę
2. komórek czerniaka B16 i ClS91 in vitro. Rozprawa doktorska. Akademia Medyczna w Bydgoszczy, 1999, str. 35-38.
3. Drewa G, Ferenc T (red.): Genetyka dla studentów i lekarzy. Wyd 2, Volumen, Urban & Partner, Wrocław, Warszawa, 2003, str. 453-455.
4. Clark MS, Wall WJ (red.): Chromosomes. The complex code. Alden Press, Oxford, 1996, str. 80-92.
5. Sokolova IA, Halling KC, Jenkins RB et al: The development of a multitarget,
6. multi-color fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn 2000, 3, 116-123.
7. Halling KC, King W, Sokolova IA et al: A comparison of cytology and fluorescence
8. in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma. J Urol 2000, 164, 1768-1775.
9. Halling KC, King W, Sokolova IA et al: A comparison of BTA stat, hemoglobin
10. dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Urol 2002, 167, 2001-2006.
11. Kipp BR, Campion MB, Coffman E et al: An evaluation of ThinPrep UroCyte filters for the preparation of slides for fluorescence in situ hybridization.
12. Diagn Cytopathol 2006, 34, 479-484.
13. Friedrich MG, Toma MI, Hellstern A et al: Comparison of multitarget fluorescence in situ hybridization in urine with other noninvasive tests for detecting bladder cancer. BJU Int 2003, 92, 911-914.
14. Kipp BR, Karnes RJ, Brankley SM et al: Monitoring intravesical therapy for superficial bladder cancer using fluorescence in situ hybridization. J Urol 2005, 173, 401-404.
15. Krause FS, Rauch A, Schrott KM, Engehausen DG: Clinical decisions for treatment of different staged bladder cancer based on multitarget fluorescence
16. in situ hybridization as-says? World J Urol 2006, 24, 418-422.
17. Pycha A, Lodde M, Comploj E et al: Intermediate-risk urothelial carcinoma: an unre-solved problem? Urology 2004, 63, 472-476.
18. Dotan ZA, Dotan A, Ramon J, Avivi L: Altered mode of allelic replication accompa-nied by aneuploidy in peripheral blood lymphocytes of prostate cancer patients. Int J Cancer 2004, 111, 60-66.
19. Tinzl M, Marberger M, Horvath S, Chypre: C.DD3PCA3 RNA analysis in urine - a new perspective for detecting prostate cancer. Eur Urol 2004, 46, 182-186.
20. Das K, Lau W, Sivaswaren C et al: Chromosomal changes in prostate cancer: a fluo-rescence in situ hybridization study. Clin Genet 2005, 68, 40-47.
21. Brown RS, Edwards J, Dogan A et al: Amplification of the androgen receptor
22. gene in bone metastases from hormone-refractory prostate cancer. J Pathol 2002, 198, 237-244.
23. Bastacky S, Cieply K, Sherer C et al: Use of interphase fluorescence in situ hybridiza-tion in prostate needle biopsy specimens with isolated high-grade
24. prostatic intraepithelial neoplasia as a predictor of prostate adenocarcinoma
25. on follow-up biopsy. Hum Pathol 2004, 35, 281-289.
26. Alcaraz A, Corral JM, Ribal MJ et al: Fluorescence in situ hybridization analysis of matched primary tumour and lymph-node metastasis of D1 (pT2-3pN1M0) prostate cancer. BJU Int 2004, 94, 407-411.
27. Karan D, Lin MF, Johansson SL, Batra SK: Current status of the molecular genetics of human prostatic adenocarcinomas. Int J Cancer 2003,103, 285-293.
28. Ropke A, Erbersdobler A, Hammerer P: Gain of androgen receptor gene copies in pri-mary prostate cancer due to X chromosome polysomy. Prostate 2004, 59, 59-68.
29. Al-Saleem T, Balsara BR, Liu Z et al: Renal oncocytoma with loss of chromosomes
30. Y and 1 evolving to papillary carcinoma in connection with gain of chromosome 7. Coincidence or progression? Cancer Genet Cytogenet 2005, 163, 81-85.
31. Corless CL, Aburatani H, Fletcher JA et al: Papillary renal cell carcinoma: quantita-tion of chromosomes 7 and 17 by FISH, analysis of chromosome 3p for LOH, and DNA ploidy. Diagn Mol Pathol 1996, 5, 53-64.
32. Receveur AO, Couturier J, Molinie V et al: Characterization of quantitative chromo-somal abnormalities in renal cell carcinomas by interphase four-
33. color fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet 2005, 158, 110-118.
34. Sanjmyatav J, Rubtsov N, Starke H et al: Identification of tumor entities of renal cell carcinoma using interphase fluorescence in situ hybridization. J Urol 2005, 174, 731-735.
35. Izumi H, Hara T, Oga A et al: High telomerase activity correlates with the stabilities of genome and DNA ploidy in renal cell carcinoma. Neoplasia 2002, 4, 103-111.
36. Gisselsson D, Gorunova L, Hoglund M et al: Telomere shortening and mitotic dysfunction generate cytogenetic heterogeneity in a subgroup of renal cell carcinomas. Br J Cancer 2004, 91, 327-332.
37. Aalfs CM, Fantes JA, Wenniger-Prick LJ et al: Tandem duplication of 11p12-
38. p13 in a child with borderline development delay and eye abnormalities: dose effect of the PAX6 gene product? Am J Med Genet 1997, 73, 267-271.
39. Muto R, Yamamori S, Ohashi H, Osawa M: Prediction by FISH analysis of the occur-rence of Wilms tumor in aniridia patients. Am J Med Genet 2002,108, 285-289.
40. Soule S, Baldridge L, Kirkpatrick K et al: HER-2/neu expression in germ cell tumours. J Clin Pathol 2002, 55, 656-658.
41. Verdorfer I, Rogatsch H, Tzankov A et al: Molecular cytogenetic analysis of human spermatocytic seminomas. J Pathol 2004, 204, 277-281.
42. Pena-Alonso R, Nieto K, Alvarez R et al: Distribution of Y-chromosome-bearing cells in gonadoblastoma and dysgenetic testis in 45,X/46,XY infants. Mod Pathol 2005, 18, 439-445.
43. Gimelli G, Giorda R, Beri S et al: A 46,X,inv(Y) young woman with gonadal dysgenesis and gonadoblastoma: cytogenetics, molecular, and methylation
44. studies. Am J Med Genet A 2006, 140, 40-45.
45. Egozcue J, Sarrate Z, Codina-Pascual M et al: Meiotic abnormalities in infertile males. Cytogenet Genome Res 2005, 111, 337-342.
46. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP: Sperm and blastomere aneuploidy detection in reproductive genetics and medicine. J Histochem Cytochem 2005, 53, 261-267.
47. Sun F, Ko E, Martin RH: Is there a relationship between sperm chromosome abnor-malities and sperm morphology? Reprod Biol Endocrinol 2006, 25, 1.

Tomasz Drewa
Zakład Inżynierii Tkankowej
ul. Karłowicza 24
85-092 Bydgoszcz
tel. (052) 585 37 37
tomaszdrewa@wp.pl