PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Metoda oceny skuteczności działania preparatów rozpuszczających złogi dróg moczowych
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1980/33/1.

autorzy

Andrzej Gomuła
Klinika Urologiczna AM w Warszawie
p.o. Kierownik Kliniki: dr hab. n.med. A. Borkowski
Badania prowadzono przy współpracy:
Instytutu Inżynierii Materiałowej Politechniki Warszawskiej
Dyrektor Instytutu: prof. dr inż. St. T. Jaźwiński
Zakładu Aparatury Unikalnej Politechniki Warszawskiej
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Z. Buczkowski

Kamica dróg moczowych (KDM) jest chorobą towarzyszącą ludzkości od najdawniejszych czasów. Kamienie moczowe wykryto w mumiach z delty Nilu pochodzących z 5000 lat p.n.e. (12). Skład chemiczny tych ka­mieni nie odbiegał od składu chemicznego złogów powstających w dro­gach moczowych u ludzi w czasach dzisiejszych.

Obecnie na KDM choruje około 1,5% ludności całego świata (7, 13). Znalezienie skutecznej metody walki z KDM ma w związku z tym duże znaczenie.

Leczenie operacyjne KDM w wielu przypadkach jest postępowaniem objawowym, a nawet paliatywnym. Usunięcie przyczyny KDM na dro­dze operacyjnej nie zawsze jest możliwe. W tej sytuacji należy uzu­pełniać leczenie operacyjne postępowaniem zachowawczym, a w części przypadków leczenie zachowawcze uznać za leczenie z wyboru (2, 5, 11).

Współczesna medycyna dysponuje coraz większym zestawem leków stosowanych w KDM. Mają one na celu zapobiegać nawrotom poope­racyjnym kamicy lub działać rozpuszczająco na złogi dróg moczowych (ZDM). W celu wyprodukowania skutecznego leku mającego zastoso­wanie w leczeniu KDM, konieczne jest kontrolowanie jego działania oraz poznanie mechanizmu jego działania. W związku ze stosowaniem w KDM leków ziołowych, celowym jest wyizolowanie z mieszaniny związków chemicznych, jakimi są te leki, substancji bezpośrednio od­powiedzialnej za efekty lecznicze. Badania takie przy użyciu opisanej poniżej metody, będą stanowić temat oddzielnej publikacji.

Dotychczasowe metody oceny leków stosowanych w KDM, nie po­zwalały na obserwację zmian jakościowych i ilościowych zachodzących w ZDM pod wpływem działania tych leków (10). ZDM są mieszaniną różnych związków chemicznych i ocena ubytku wagi złogu nie infor­muje o tym, jaki związek chemiczny ZDM uległ rozpuszczeniu (10).

Ponadto poddawanie ZDM działaniu leków w warunkach in vitro po­mija zmiany, którym ulega lek przechodząc z przewodu pokarmowe­go do moczu, a właśnie w moczu lek ma rozwijać swoje działanie te­rapeutyczne.

Prowadzenie oceny skuteczności leku w warunkach klinicznych jest trudne, bowiem nie można ustalić żadnej grupy kontrolnej przy ocenie skuteczności rozpuszczania ZDM (9). Kontrolę można uzyskać jedynie przy ocenie działania ubocznego leku.

Badania, w których efekt rozpuszczający leku ocenia się na podstawie zmniejszania się ZDM na kolejnych zdjęciach rentgenowskich (9), nie są precyzyjne i nie pozwalają ustalić, jaki rodzaj ZDM ulega rozpu­szczeniu, bądź jakie jego składniki są rozpuszczane.

Wobec braku informacji mówiących dokładnie o skutkach działania ilościowego, jak również jakościowego leków rozpuszczających ZDM, postanowiono podjąć badania w celu ustalenia metody pozwalającej na ocenę stosowanych w KDM preparatów o działaniu rozpuszczają­cym ZDM. W tym celu zastosowano nowoczesną aparaturę analityczną używaną do prac badawczych w technice, a ostatnio również w nie­których działach nauk medycznych i biologicznych. Starano się ustalić metodę, która pozwoliłaby w szybki i dokładny sposób ocenić zmiany jakościowe i ilościowe zachodzące w ZDM, podczas działania leków roz­puszczających. Z powodu niemożności prowadzenia tych obserwacji w ustroju żywym, postanowiono wytworzyć model pozwalający na pro­wadzenie prac in vitro, w warunkach jak najbardziej zbliżonych do naturalnych.

Praca stanowi próbę ustalenia metody do oceny działania preparatów rozpuszczających złogi dróg moczowych (ZDM). Procesy zachodzące w ZDM w czasie rozpuszczania niektórych jego faz oceniano ilościowo i ja­kościowo. W tym celu zastosowano mikroanalizator promieni X, spektro­fotometr podczerwieni oraz elektronowy mikroskop skaningowy (1, 4, 6).

W dostępnym piśmiennictwie autor nie znalazł opisu metody, w któ­rej przy użyciu mikroskopu skaningowego, mikroanalizatora promieni X i spektrofotometru podczerwieni ocenianoby zmiany zachodzące w ZDM pod wpływem preparatów farmakologicznych. Ponadto zastoso­wany w badaniach model doświadczalny również nie był dotychczas publikowany.

Materiał i metoda

Użycie do badań elektronowego mikroskopu skaningowego, pozwoliło na ocenę powierzchni przekroju ZDM ze znacznie większą dokładnością, niż przy użyciu klasycznego mikroskopu optycznego. Zdolność roz­dzielcza elektronowego mikroskopu skaningowego, jak i głębia ostrości, jest 300 X większa niż dla mikroskopu optycznego. Płynna zmiana po­większeń od 30 X do 30000 X, pozwala na wygodną ocenę preparatu. Zasada działania elektronowego mikroskopu skaningowego polega na wy­korzystaniu wtórnych elektronów do tworzenia obrazu.

Do badania ZDM stosowano prąd wiązki elektronów 10-10A przy na­pięciu przyspieszającym 25 KV. Dla uzyskania przewodności badanej próbki pokrywano ją węglem, a po zakończeniu analizy jakościowej do­datkowo napylano próbkę złotem w napylarce próżniowej. Próbki umie­szczano w komorze mikroskopu w próżni 10-3 Torra. Używano powiekszeń od 30 X do 24000 X dobierając je tak, ażeby obserwacja struk­tury badanej próbki dawała o niej możliwie największą ilość informacji.

Używane do badań próbki stanowiły fragmenty ZDM uzyskiwanych drogą operacyjną. Poprzez krojenie złogu na fragmenty o wielkości 50 mm3 uzyskiwano z jednego kamienia nerkowego liczne próbki. W ten sposób badając działanie różnych leków na fragmenty tego samego kamienia poprzez eliminację zależności działania leku od rodzaju ka­mienia, możliwe było prowadzenie badań porównawczych różnych le­ków. Każda z próbek była zatapiana w żywicy akrylowej, w pierście­niu teflonowym, o wymiarach limitowanych przez wielkość uchwytów mikroskopu skaningowego i mikroanalizatora promieni X. Powierz­chnię próbki szlifowano, a następnie badano na niej rozmieszczenie pierwiastków chemicznych takich jak: fosfor, węgiel, wapń, azot i magnez. Do badań używano mikroanalizatora promieni X f-my JEOL typ JXA-3A.

Elektronowy analizator pozwala na wykonanie analizy jakościowej i ilościowej mikroobszaru o objętości zaledwie kilku m3. Wiązka elektro­nów wysłana z emitera jest ogniskowana w wybranym punkcie na po­wierzchni próbki. Uderzające o powierzchnię próbki elektrony powo­dują emisję promieniowania rentgenowskiego, charakterystycznego dla pobudzonych elektronami atomów. Promieniowanie rentgenowskie jest analizowane za pomocą spektrometru rentgenowskiego. Intensywność promieniowania, którą mierzy się za pomocą specjalnego licznika, jest proporcjonalna do ilości badanego pierwiastka. Automatyczny przesuw wiązki elektronów, bądź próbki, umożliwia wykonanie analizy liniowej lub powierzchniowej, co pozwala na ocenę rozmieszczenia poszczegól­nych pierwiastków w badanym obszarze. Ryciny 1—4 pochodzą z mi­kroanalizatora promieni X i przedstawiają rozmieszczenie na badanej powierzchni pierwiastków chemicznych. Analizę próbek prowadzono wiązką elektronów o natężeniu 2X10-7A przy napięciu 10 KV. Pole A, stanowiące część badanego obszaru, złożone jest z fosforanu magnezu i fosforanu wapnia, zaś pola B ze szczawianu wapnia. Wapń rozmiesz­czony jest równomiernie na całym badanym obszarze. Fosfor znajduje się wyłącznie w polu A podobnie jak magnez, którego w badanym miejscu na powierzchni próbki jest ilościowo mniej niż fosforu. Węgiel znajduje się w polach 53. Jasne kropki w polu A na rycinie 3 spowo­dowane są obecnością węgla w tym obszarze po napyleniu próbki jako przygotowania do badań elektronowych.

Określenie związku chemicznego, w którym znajdował się wykryty przy pomocy mikroanalizatora fosfor i węgiel, przeprowadzono na pod­stawie analizy spektralnej fragmentu kamienia nerkowego w spektrofo­tometrze podczerwieni F-my Perkin-Elmer model 557,. Aparat ten mie­rząc intensywność promieniowania podczerwonego o pewnym przedzia­le liczb falowych, a przepuszczonego przez badane związki chemiczne, pozwala z dużą dokładnością określić ich budowę. Wykrywanie tą tech­niką fosforanów, szczawianów i innych związków chemicznych w ZDM jest metodą ogólnie przyjętą (1, 4). Badania prowadzono techniką płyt­ki KBr w zakresie 4000 : 400 cm"1. Rycina 5 przedstawia spektrogram w podczerwieni fragmentu kamienia nerkowego. Absorbcja w paśmie 1035 cm-1 świadczy o występowaniu w badanej próbce fosforanów, zaś absorpcja w pasmach 1320, 780 i 520 cm"1 spowodowana jest wys­tępowaniem w danej próbce szczawianów.

Następnie za pomocą mikroskopu skaningowego f-my JEOL typ JSM-2 badano powierzchnię całej próbki w celu potwierdzenia gładkości przed rozpoczęciem jej rozpuszczania.

Tak przygotowaną i znaną pod względem składu chemicznego po­wierzchnię próbki poddawano działaniu moczu, który zawierał badany preparat farmakologiczny. Mocz do badań uzyskiwano w czasie przyj­mowania przez pacjentów leku drogą doustną. Prowadzono badania następujących leków: ,,Fitolizyny" w dawce 3X5,0, ,,Rubinexu" w dawce 3X2 tabl., „Rubiolizyny" w dawce 3X5,0, „Extractum Rubiae Tinc." w dawce 3X2 tabl. oraz ,,Uralytu" w dawce 3X2 tabl. Lek podawano w ciągu 8 godzin co 4 godz., a do badania używano 30,0 ml moczu w ogólnej ilości zebranej w czasie 12 godzin.

Tak stosowane leki, mając działanie rozpuszczające wobec KDM, były po przejściu przez przewód pokarmowy w sposób naturalny wpro­wadzone do moczu. Prowadząc rozpuszczanie w temperaturze 37°C uzyskiwano warunki zbliżone do tych, jakie panują w drogach mo­czowych. Do badania używano moczu osób chorych na KDM oraz mo­czu ludzi zdrowych. Kontrolę stanowiły próbki pochodzące z tego sa­mego złogu poddawane działaniu moczu nie zawierającego leku, ale pochodzącego od tych samych osób. Powierzchnię badanych próbek poddawano działaniu moczu przez okres 24 godzin. W celu uniknięcia wzrostu bakterii w czasie rozpuszczania dodawano do moczu 1,0 ml 0,05% roztworu wodnego Hibitanu. Równocześnie prowadzono kontro­lę, mającą na celu wykluczenie wpływu Hibitanu na proces rozpuszcza­nia. Rozpuszczanie powierzchni prowadzono w 30,0 ml moczu, używając teflonowych mieszadeł magnetycznych. W czasie badań stwierdzono, że zwiększenie czasu kontaktu próbki z moczem ponad 24 godziny nie po­woduje dalszego rozpuszczania jej powierzchni.

Za pomocą opisanej metody przeprowadzono badania 300 próbek kamieni nerkowych używając pięciu uprzednio wymienionych leków. Wyniki porównawcze działania tych leków nie stanowią tematu tej pra­cy i zostaną podane w oddzielnej publikacji.

Wyniki

Ocena w mikroskopie skaningowym tych samych miejsc na po­wierzchni badanej próbki przed (ryc. 7) i po jej rozpuszczaniu po­zwoliła ustalić, że w wyniku działania niektórych leków fosforany ule­gają, zaś szczawiany — nie ulegają rozpuszczeniu. Najlepiej rozpuszczal­nym fosforanem jest fosforan amonowo-magnezowy. Nie ulegają roz­puszczeniu białkowe matryce organiczne (3, 8), które po rozpuszczeniu składników nieorganicznych kamieni nerkowych stanowią siatkę włókien. Rycina 8 przedstawia fragment powierzchni kamienia nerkowe­go, na której po rozpuszczeniu fosforanów „Rubiolizyną" pozostała wy­łącznie siatka włókien białkowych, stanowiących organiczną matrycę kamienia nerkowego.

Ponadto stwierdzono, że rozpuszczanie fosforanów moczem ludzi zdro­wych jest o 20% większe niż w moczu ludzi chorych na KDM. Fakt ten wydaje się potwierdzać istnienie w moczu ludzi zdrowych czyn­nika mającego wpływ na zachowanie się substancji krystalicznych.

W celu ilościowej oceny procesu rozpuszczania rozpuszczalnej fazy, oglądano badane fragmenty kamieni nerkowych w mikroskopie skanin­gowym, pochylając próbkę pod kątem 40°. Rycina 9 przedstawia frag­ment powierzchni kamienia nerkowego po częściowym rozpuszczeniu fosforanów preparatem „Rubinex. Pochylenie próbki pozwoliło stwier­dzić, że powierzchnia złożona z fosforanów na skutek rozpuszczania ule­gła obniżeniu w stosunku do powierzchni nierozpuszczalnej żywicy akrylowej, w której badany fragment kamienia został zatopiony. W centrum widoczne są dwa kryształy szczawianu wapnia, które pierwot­nie wtopione w fosforany nie uległy rozpuszczeniu, podobnie jak leżące obok włókno białkowe matrycy organicznej kamienia.

Znając powiększenie mikroskopu i kąt pochylenia próbki ustalono głębokość, na jaką następowało rozpuszczenie próbki, a po określeniu powierzchni, która uległa rozpuszczeniu wyliczono, jaka objętość ka­mienia nerkowego uległa rozpuszczeniu.

Należy z całą stanowczością podkreślić fakt, że rozpuszczenie nie­których związków chemicznych, stanowiących składniki KDM, nastę­puje w ilościach uchwytnych dla mikroskopu. Badania prowadzone były mikrometodami przy użyciu niewielkiej ilości moczu, zawierającego pre­paraty farmakologiczne. Opierano się w tym przypadku na założeniu, że jeśli dany preparat nie wywołuje zmian ilościowych w badaniach mikroskopowych to nie będzie on również wykazywał swego działania w stosunku do ZDM w warunkach in vivo. Uzyskanie wyników pozy­tywnych nie jest jednak równoznaczne z praktyczną skutecznością le­ków w KDM.

Badania — przy użyciu powyższej metody — mają na celu ocenę do­tychczas stosowanych leków, jak również przyspieszyć badania nad no­wymi preparatami. Czas wykaże, czy leczenie zachowawcze KDM będzie skuteczne.

Wnioski

1. W oparciu o podaną metodę można ocenić jakościowo i ilościowo działanie rozpuszczające preparatów stosowanych w leczeniu KDM.

2. Metoda pozwala na ustalenie frakcji czynnej preparatu ziołowego i umożliwia tym samym standaryzację dawki leków ziołowych, których biologiczna czynność jest zmienna. Ponadto ustalenie frakcji czynnej stwarza możliwość podjęcia prób syntezy tej substancji.

3. Przy badaniach nowych leków można zmodyfikować metodę stosując do rozpuszczania mocz zwierząt doświadczalnych, zawierający lek. W ten sposób wielomiesięczne badania na zwierzętach można skrócić do kilku dni.

4. Zastosowanie nowych metod badawczych pozwala na dokładniej­sze poznanie działania leków na ZDM i być może przyczyni się do po­stępu prac nad zachowawczym leczeniem KDM.

Badania nad opracowaniem omawianej metody trwały ponad trzy lata. W tym czasie autor wielokrotnie korzystał z pomocy i rad pra­cowników naukowych Politechniki Warszawskiej oraz unikalnej apa­ratury, stanowiącej własność tej Uczelni. Dzięki serdecznej opiece Prof. dra inż. Stanisława T. Jaźwińskiego, Prof. dra hab. Zbigniewa Bucz-kowskiego, Doc. dra inż. Andrzeja Szummera oraz wielu innych wy­bitnych specjalistów różnych specjalności technicznych i medycznych możliwe było prowadzenie badań, mających na celu walkę z kamicą dróg moczowych. W tym miejscu autor składa Im wszystkim serdeczne podziękowanie.

piśmiennictwo

  1. Bellanato J., Cifuentes Delatte L., Hid'lgo A., Santos M.: Application of infrared spetroscopy to the study of renal stones, Urinary calculi, S. Kargel, 1973; 237.
  2. Borkowski A.: Wznowy i problem zapobiegania im w tak zwanych „kamicach miękkich", Pol. Tyg. Lek., 1976, 51; 2175.
  3. Boyce W. H.: Organie matrix of human urinary coneretions, Am. J. Med., 1968, 45; 673.
  4. Fryszman A. Mikuszewski J.: Metody fizykochemiczne stosowane dla cceny składu kamieni moczowych, Pol. Przeg. Chir., 1977, 49, 2, 101.
  5. Hange A., Nagel R.: Auflósung von Phosphatsteinen durch orale Medikation, Der Urologe, 1968, 7; 52.
  6. He-on experimental vesical calculi, Brit. J. Urol., 1953; 33.
  7. Hienzsch E., Schnei-der H. J.: Der Hanstein, Fischer, Jena, 1973.
  8. Kimura Y., Kisaki N., Ise K.: The role of the matrix substance in formation of urinary stones, Urol. Int. 1976, 31; 355.
  9. Leńko J., Cieśliński S., Miękoś E., Mądry K., Leńko Z.: Ocena klinicz­na preparatu „Rubiolizyną", Biul. WAM 1975, XVIII, 1; 118.
  10. Miękoś L., Mądry K.: Chemioliza kamieni fosforanowo-wapniowych i szczawianowo-wapniowych w roztworach „Rubiolizyny". Biul. WAM 1974, XVII, 4; 635.
  11. Moore C. A., Bunce C. H.: Reduction of freąuency of renal calculus forma-tion by orał magnesium administration, Invest. Urol., 1964, 2; 7.
  12. Shattock S. G,: A prehistorie or predynastic Egyptian calculus, Trans. Path. Soc. Lond., 1905, 61; 275.
  13. Zollinger H. U.: Niere und ableitende Harnwege w książce: W. Doerr, E Uehlinger — Speziale pathologische Anatomie, Springer, Berlin — Heidelberg — New York 1966.

adres autorów

ul. Rakowiecka 45 m 32
02-528 Warszawa