OCENA AKTYWNOŚCI METABOLICZNEJ GRANULOCYTÓW OBOJĘTNOCHŁONNYCH W TESTACH REDUKCJI NBT U CHORYCH NA RAKA NERKI
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1984/37/2.

W celu pełniejszej diagnozy przewlekłej choroby ziarniczej Park i współpracownicy wprowadzili stymulowany test redukcji błękitu nitro-tetrazoliowego NBT (10, 11). Jak się okazało granulocyty obojętnochłon­ne chorych obarczonych tą chorobą nie wykazywały zdolności do reduk­cji NBT również po ich stymulacji. Idąc tym śladem test redukcji NBT stosowano przede wszystkim w tych chorobach nowotworowych, które charakteryzowały się rozrostem ogólnoustrojowym, a punktem wyjścia były różne komórki szeregu krwiotwórczego (2, 6, 7, 12). Wyniki prowa­dzonych uprzednio badań czynności fagocytarnej granulocytów obojętno­chłonnych w niektórych chorobach nowotworowych nie były jednoznacz­ne (3, 8, 9, 15). Dlatego podjęto próbę oceny aktywności [metabolicznej granulocytów obojętnochłonnych krwi obwodowej u chorych na raka nerki. Przebadano zdolność granulocytów do redukcji błękitu nitrotetra-zoliowego NBT bez stymulacji oraz stymulowanych lipopolisacharydem E. coli (LPS).

MATERIAŁ I METODYKA

Przebadano 44 chorych w tym 32 mężczyzn i 12 kobiet leczonych w Klinice w latach 1980?1983 z powodu raka nerki. W oparciu o ba­dania kliniczne, śródoperacyjne i badania histologiczne dokonano po­działu wg systemu TNM-V oraz wg klasyfikacji Hollanda i Robsona na stadia kliniczne I?IV (4, 13, 14). Wyniki oceniano w połączonych gru­pach chorych I+II oraz III + IV wg tej klasyfikacji. Ogólną liczbę gra­nulocytów krwi obwodowej wyliczano z całkowitej liczby krwinek bia­łych w 1 mm3 i wartości odsetkowych z rozmazów barwionych metodą May Grunwalda-Giemsy. Aktywność metaboliczną granulocytów obojęt­nochłonnych określano w testach redukcji błękitu nitroterazoliowego NBT spontanicznym NBT-sp i stymulowanym NBT-st wg metody opi­sanej przez Parka i współpracowników (10), Parka i Gooda (11) oraz przez Grządzielską (3). Wyniki testów redukcji NBT podano w odsetkach i w wartościach bezwzględnych komórek NBT-dodatnich. Przedstawiono je również za pomocą względnych współczynników aktywności metabo­licznej granulocytów WAMG-sp dla testu spontanicznego i WAMG-st dla stymulowanego (1). Współczynniki te wyliczano na podstawie na­stępującego wzoru:

Przy interpretacji różnicy wartości obu testów zastosowano wprowadzo­ny przez Turowskiego współczynnik ?Indeks fagocytozy IF" (16, 17).

W kontrolnej grupie osób nie obciążonych nowotworem (N=46) wy­niki testów redukcji przedstawiały się wg Grządzielskiej (3) następują­co:

NBT-sp: 9,3% ?3,7 oraz 309,0 ?129,0 komórek NBT-dodatnich w mm3, NBT-st: 40,9% ?10,4 oraz 1385,0 ?451,0 komórek NBT-dodatnich w mm3.

W stanach prawidłowych względny współczynnik aktywności metabo­licznej (granulocytów WAMG przybierał wartość 1,0, a indeks fagocyto­zy IF wartość 1,0 z zakresem SD ?0,34. Przedstawione wyniki w formie średnich arytmetycznych z odchyleniami standardowymi poddano ana­lizie statystycznej stosując test T-Studenta oraz test chi2 (19).

WYNIKI

Średnia wartość liczby krwinek białych była wyższa od średniej dla grupy kontrolnej. Różnica ta nie była znamienna. Obserwowano nato­miast znamienny wzrost odsetka i bezwzględnej liczby granulocytów obo­jętnochłonnych krwi obwodowej u chorych na raka nerki (tabela I).

Badając reakcję granulocytów bez stymulacji stwierdzono u chorych na raka nerki znacznego stopnia wzrost odsetka i bezwzględnej liczby komórek tworzących złogi formazanu, który w porównaniu z wartościa­mi grupy kontrolnej okazał się znamienny. Wzrost ten kojarzył się ze znacznego stopnia upośledzeniem odpowiedzi granulocytów obojętnochłon­nych chorych na raka nerki na stymulację LPS E. coli, co przejawiało się w znamiennym spadku odsetka i bezwzględnej liczby komórek NBT--dodatnich w teście stymulowanym (tabela II). W tabeli II zestawiono również średnie współczynników aktywności metabolicznej granulocytów WAMG. Średnia dla WAMG-sp była dwukrotnie wyższa, a dla WAMG-st dwukrotnie niższa od przyjętej dla populacji ludzi zdrowych średniej wartości WAMG = 1,0.

W grupach chorych obserwowano również znamienny wzrost wartości odsetkowych i bezwzględnych testu NBT-sp przy znacznego stopnia upo­śledzeniu odpowiedzi na stymulację LPS. Nie było natomiast znamien­nych różnic w wynikach dla badanych grup chorych (tabela III, IV).

W tabeli V zestawiono wartości współczynnika indeksu fagocytozy IF w oparciu o NOT. Średnia wartość współczynnika wynosiła 0,14 i odpo­wiadała prawie pięciokrotnie mniejszemu przyrostowi odsetka komórek NBT-dodatnich po stymulacji LPS od przyjętego dla dolnej granicy nor­my. Współczynnik IF przybierał wartości prawidłowe jedynie u 20,5% badanych chorych na raka nerki. U 80,0°/o chorych obserwowano brak odpowiedzi granulocytów obojętnochłonnych na stymulację lipopolisacha­rydem E. coli (tabela VI).

Porównując odsetki prawidłowych wyników stwierdzono znamiennie wyższy odsetek prawidłowych reakcji leukocytów u chorych z mniej zaawansowanym (grupa I+ II) procesem nowotworowym od obserwowa­nego w bardziej zaawansowanej klinicznie grupie III + IV (tabela VII).

DYSKUSJA

Uprzednie badania potwierdziły przydatność testu redukcji NBT w diagnozowaniu zakażeń bakteryjnych, różnicowania ich z wirusowymi i w ocenie doboru leczenia w tych stanach chorobowych (1, 5, 10, 18). Wyniki badań czynności fagocytarnej granulocytów u chorych z nowo­tworami nie były jednoznaczne (2, 6, 7, 8, 9, 12, 15). Grządzielska ob­serwowała u chorych na nowotwory krtani, żołądka, odbytnicy i płuc podwyższone wartości testu NBT-sp, przy prawidłowej reakcji w nowo­tworach macicy. Obserwowała także prawidłową odpowiedź granulocy­tów na stymulację LPS u chorych na raka płuc (3). Interpretacja wyni­ków testów redukcji u chorych na nowotwory złośliwe jest trudna. Uprzednie badania wykazały, że u ludzi zdrowych odsetek i bezwzględna liczba granulocytów redukujących sól sodową NBT w teście spontanicz­nym są niskie, natomiast ulegają znacznemu podwyższeniu po stymula­cji komórek LPS lub cząsteczkami lateksu '(3, 11, 18). W takim też sto­sunku do siebie pozostawały wyniki obu testów w grupie kontrolnej. Przyjmując, że test NBT jest wyrazem intensyfikacji przemian energe­tycznych zachodzących w granulocytach w procesie fagocytozy, to zwięk­szenie liczby komórek tworzących złogi formazanu ma miejsce gdy na­stępuje zaangażowanie granulocytów w proces fagocytozy (3, 10, 11, 18). Obserwowany u chorych na raka nerki znamienny wzrost odsetka i bez­względnej liczby komórek NBT-dodatnich w teście NBT-sp można in­terpretować jako ?nieswoistą" stymulację fagocytozy w przypadku roz­padu tkanek guza, odczynu zapalnego, czy też dołączającego się zakaże­nia (3, 5, 8, 9). Dodatkowe zwiększenie liczby komórek NBT-dodatnich w stanach chorobowych takich, jak przewlekłe ropienia i zapalenia lub skutkiem pobudzenia in vitro pozwala sądzić, że nie wszystkie granulo­cyty zdolne do fagocytozy brały udział w tym procesie. Grządzielska są­dzi, że w ustroju ?zdrowym" istnieje dodatkowa rezerwowa pula gra­nulocytów zdolnych do fagocytozy (3). U chorych na raka nerki obser­wowano znacznego stopnia upośledzenie odpowiedzi granulocytów na stymulację LPS, przy wysokich wartościach odsetkowych i bezweględ- . nych granulocytów reagujących bez stymulacji. Te przeciwne tendencje reagowania wyrażono za pomocą współczynnika indeksu fagocytozy w oparciu o NBT ? ?IF" (16, 17). Dla populacji ludzi zdrowych przyj­muje on wartość 1,0 z zakresem SD ?0,34. Innymi słowy oznacza to, że za prawidłowe uznaje się podwyższenie średnio o 30,0°/o odsetka komó­rek NBT-dodatnich po stymulacji LPS. Dla chorych na raka nerki ob­serwowano prawie pięciokrotnie mniejszy przyrost komórek tworzących złogi formazanu niż przyjęty dla dolnej granicy normy. Wykazano zna­miennie wyższy odsetek prawidłowych wyników u chorych z mniej za­awansowanym nowotworem (grupa I+II) w porównaniu z bardziej za­awansowaną klinicznie grupą III + IV. Znacznie większe upośledzenie zdolności do redukcji NBT pod wpływem LPS wykazywali uprzednio badani chorzy na raka nerki obarczeni przerzutami (8).

Analiza różnicy spontanicznie reagujących granulocytów w teście NBT-sp i granulocytów redukujących błękit nitrotetrazoliowy pod wpły­wem stymulacji LPS wskazywałaby na znacznego stopnia ilościowe zmniejszenie hipotetycznej ?rezerwowej" puli granulocytów obojętno­chłonnych zdolnych do fagocytozy u chorych na raka nerki lub też na upośledzenie ich funkcji przyjmując, że test NBT jest tej funkcja od­zwierciedleniem.

WNIOSKI

1)W badaniach immunologicznych u chorych na raka nerki wydaje się celowe określanie aktywności metabolicznej granulocytów obojętno­ chłonnych w obu testach redukcji NBT, niezależnie z badaniami dotyczą­ cymi funkcji i składu subpopulacji limfocytów krwi obwodowej.

2)Jakkolwiek analiza wyników testów redukcji NBT w chorobie nowotworowej jest trudna, to obserwacje poczynione u chorych na raka nerki wskazują na możliwość szerszej interpretacji roli tych filiogene- tycznie starszych komórek układu odpornościowego. Test NBT zatem może być nie tylko odzwierciedlaniem zakażeń, lecz przejawia zapotrze­ bowanie organizmu na fagocytozę komórek bądź w procesie regeneracji lub rozpadu guza.

3)Współczynnik IF ? indeksu fagocytozy obliczany na podstawie wyników testów redukcji NBT okazał się przydatny w ocenie reaktyw­ ności chorych na raka nerki.

1. 1. Bjórksten B., Ekstrand T., Gothejors L., Ostberg Y.: The nitroblue tetrazo­
2. lium (NBT) test and white blood cell count in acute throtat infections. Scand. J.
3. Infect. Dis., 1975, 7, 45. ? 2. Chang J. C, Appleby J., Bennet J., Rochester N. Y..
4. Nitroblue tetrazolium test in Hodkin's disease and other malignant lymphomas.
5. Arch. Intern. Med., 1974, 133, 401. ? 3. Grządzielska E. B.: Próba oceny zdolności
6. do fagocytozy granulocytów obojętnochłonnych aa pomocą testu (redukcji błękitu
7. nitrotetrazoliowego. Rozprawa doktorska, Akademia Medyczna, Kraków, 1976. ? 4.
8. Holland J. M.: Cancer of the kidney ? natural history and staging. Cancer, 1973,
9. 32, 1030. ? 5. Humbert J. R., Marks M. L, Hathaway W. E., Thoren C. H.: The
10. histochemical nitroblue tetrazolium test to differential diagnosis of acute infection.
11. Pediatrics, 1971, 48, 259. ? 6. Jędrzejczak W. W., Siekierzyński M.: Nitroblue tetra­
12. zolium test in lymphoma. Am. J. Clin. Path., 1974, 61, 576. ? 7. Kobielowa Z.,
13. Kolanowska H., Zajączkowski J.: NBT-dye test in lyrnphoproliferative diseases in
14. children. Int. Congress Allergol. and Clinical Immunol, Materials of Conference,
15. Prague 1974. ? 8. Kwinta A.. Próba oceny reaktywności immunologicznej u cho­
16. rych na raka nerki z przerzutami. Urol. Pol., 1983, XXXVI, 4, 323. ? 9. Lehane D. E.,
17. Watson S., Lane M.: The nitroblue tetrazolium test in patients with adwanced neo­
18. plastic diseases. Cancer, 1975, 35, 1421. ? 10. Park B. H., Fikrig S. M., Smithwick
19. E. M.: Infection and nitroblue tetrazolium reduction by neutrophils. A diagnostic
20. aid. Lancet, 1968, 2, 532.
21. 11. Park B. U., Good R. A.: NBT test stimulated. Lancet, 1970, 2, 616. ? 12.
22. Pilgrim U., Hitzig W. H., Pluss H. J., Ruckli B.: Nitroblue-tetrazolium (NBT) reduc­
23. tion in leukoocytes of children with acute leukemia. Heiv. Paediat. Acta, 1974, 29,
24. 315. ? 13. Rattenhuber U., Wieland W.: Diagnostik und Tharapie des Nierenkarza-
25. ooms. W. Zuckschwerdt, Mumchen 1981. ? 14. Robson C. J., Churchill B. M., Ander­
26. son W.: The results of radical nephrectomy for renal cell carcinoma. J. Uroi., 1969,
27. 101, 297. ? 15. Silverman E. M., Reed R. E.: The nitroblue tetrazolium test in
28. lymphoma. Am. J. Clin. Pathol., 1973, 59, 198. ? 16. Turowski G.: Informacja
29. własna, 1983. ? 17. Turowski G.: Względny współczynnik aktywności rozetowej
30. limfocytów (WARL) dla testów TEa i TEt oraz współczynnik aktywności metabo­
31. licznej granulocytów (WAMG) dla testów NBT w ocenie stanu immunologicznego
32. chorych. 3 Zjazd Pol. Tow. Immunolog., ?Immunologia w medycynie", Poznań,
33. 1980. ? 18. Turowski G., Kapińska-Mrówka M.: Badania nad [reaktywnością im-
34. muniologicana. chorych na łuszczycę zwykłą. IV. Akytwność metaboliczna granulo­
35. cytów obojętnochłonnych w testach redukcji błękitu nitrotetrazoliowego (NBT)
36. spontanicznym i stymulowanym. Brzeg. Dermat., 1981, 68, 1. ? 19. Woolf Ch. M.:
37. Statistics for biologists. Principles of biometry. D. van Nostrand, Toronto, London.
38. Melbourne 1968.