PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Ocena niektórych parametrów reaktywności typu komórkowego w populacji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej u chorych na gruczolakoraka stercza
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2005/58/3.

autorzy

Anna Helmin-Basa 1, Lidia Gackowska 1, Małgorzata Wyszomirska-Gołda 1, Marcin Sawicki 3, Ryszard Gołda 1, Izabela Kubiszewska 1, Jacek Michałkiewicz 1, Zbigniew Wolski 2, Aleksander Łapuć 2
1 Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Katedra i Zakład Immunologii Collegium Medicum w Bydgoszczy
Kierownik katedry i zakładu: dr hab. prof. UMK Jacek Michałkiewicz
2 Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Katedra i Klinika Urologii Collegium Medicum w Bydgoszczy
Kierownik katedry i zakładu: prof. dr hab. Zbigniew Wolski
3 Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Collegium Medicum w Bydgoszczy
Kierownik katedry i zakładu: prof. dr hab. Grażyna Odrowąż-Sypniewska

słowa kluczowe

stercz, gruczolakorak stercza, cytokiny, limfocyty, monocyty, odpowiedź proliferacyjna, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej

streszczenie

Wstęp.
Aktywacja limfocytów T odgrywa ważną rolę w odpowiedzi przeciwnowotworowej. U chorych na nowotwory obserwuje się liczne zaburzenia w funkcjonowaniu odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego.
Cele pracy.
1. Ocena odpowiedzi proliferacyjnej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) indukowanych przeciwciałami anty-CD3 w grupie chorych na gruczolakoraka stercza.
2. Określenie profilu cytokin wydzielanych przez PBMC po stymulacji przeciwciałami anty-CD3 w grupie chorych na gruczolakoraka gruczołu krokowego.
Materiał i metody.
Materiał badany stanowiły komórki jednojądrzaste krwi obwodowej pochodzące od pacjentów z gruczolakorakiem stercza i od zdrowych dawców krwi stanowiących grupę kontrolną. W celu oceny odpowiedzi proliferacyjnej PBMC posłużono się metodą opartą o inkorporację tymidyny znakowanej trytem przez proliferujące komórki. Oznaczanie stężenia cytokin tj. IFN-g, TNF-a, IL-10, IL-12 i IL-6 w nadsączach z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po stymulacji przeciwciałami anty-CD3 oraz bez stymulacji w grupie pacjentów z gruczolakorakiem stercza i w grupie kontrolnej wykonano wykorzystując technikę immunoenzymatyczną ELISA.
Wyniki.
U chorych na gruczolakoraka stercza stwierdzono obniżoną odpowiedź proliferacyjną PBMC po indukcji przeciwciałami anty-CD3. Poziom jednej z podstawowych cytokin profilu Th1-IFN-g był obniżony, przy niezmienionym stężeniu TNF-a w stosunku do grupy kontrolnej. Stężenie IL-12 wykazywało tendencję wzrostową w grupie badanych chorych, jednakże bez różnic istotnych statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną. W przypadku oznaczanych cytokin profilu Th2 stwierdzono brak istotnych różnic w stężeniu IL-10 między grupą chorych a grupą kontrolną, przeciwnie niż dla IL-6. Badania wykazały, że pacjenci z gruczolakorakiem stercza odpowiadali wyraźnym, spontanicznym wzrostem syntezy IL-6.
Wnioski.
Otrzymane wyniki wskazują na występowanie zaburzonej równowagi w obrębie syntezy cytokin profilu Th1/Th2 u chorych na gruczolakoraka stercza. Tak zmieniona odpowiedź komórkowa, zależna od limfocytów typu Th1 może sprzyjać progresji nowotworu. Oznaczanie aktywności proliferacyjnej oraz poziomów limfokin i monokin wydzielanych przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej może odzwierciedlać stan przeciwnowotworowej aktywności układu odpornościowego.

Wstęp

W przypadku procesu nowotworowego układ odpornościowy włącza się do odpowiedzi immunologicznej stosunkowo późno. Komórki nowotworowe zostają rozpoznane dopiero w momencie pojawienia się antygenów związanych z nowotworem TAA (tumor associated antigens) i specyficznych antygenów nowotworowych TSA (tumor specific antigens). Niedostateczna funkcja przeciwnowotworowa układu odpornościowego prowadzi do tzw. ucieczki zmienionych komórek spod nadzoru immunologicznego, co sprzyja progresji nowotworzenia [1-5]. Istnieje kilka teorii tłumaczących to zjawisko. Komórki nowotworowe mogą mieć obniżoną i zmienioną ekspresję antygenów zgodności tkankowej MHC klasy I i II [6]. Innym rodzajem ucieczki spod nadzoru immunologicznego jest brak cząstek kostymulujących, tj. CD80 i CD86 [7]. Ponadto immunogenność komórek nowotworowych może obniżać się również w wyniku zmniejszania się ich antygenowości. Zjawisko to określa się jako maskowanie antygenów. Osłabiona reaktywność immunologiczna związana jest także z mechanizmem ?prześlizgiwania się?. Zjawisko to polega na tym, że mała liczba komórek nowotworowych indukuje odpowiedź, natomiast duże stężenie tych komórek działa hamująco na mechanizmy przeciwnowotworowe. Ponadto hamująco na odpowiedź immunologiczną mogą wpływać czynniki uwalniane przez komórki nowotworowe, tj. TGF-b, IL-10 [8,9] czy VEGF. Wykazano, że komórki nowotworowe i PSA w raku stercza hamują powstawanie i dojrzewanie komórek dendrytycznych, co zaburza rozpoznawanie, przetwarzanie i prezentację TAA [10,11]. U chorych z nowotworem dochodzi do przyspieszonej apoptozy komórek prezentujących antygen nowotworowy. Rozwój nowotworu jest ułatwiony poprzez liczne mutacje genu dla TNF-a, co hamuje jego działanie przeciwnowotworowe i blokuje apoptozę komórek nowotworowych [12].

Prawdopodobnie pojawienie się tkanki nowotworowej powoduje załamanie obrony immunologicznej w organizmie gospodarza. Zjawisko to obserwuje się także u chorych na raka stercza [13].

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, tj. limfocyty T cytotoksyczne (Tc), limfocyty T pomocnicze (Th), komórki NK, limfocyty B to bardzo ważne elementy odpowiedzi przeciwnowotworowej. Limfocyty Tc należą do subpopulacji limfocytów CD8+. Rozpoznają i eliminują własne komórki mające na powierzchni obce antygeny, np. nowotworowe. Zabijają komórki, rozpoznając obce MHC klasy I lub obce antygeny prezentowane przez własne MHC klasy I. Innym typem komórek cytotoksycznych są komórki NK. Są to limfocyty zdolne do spontanicznego zabijania komórek, w tym komórek nowotworowych nieposiadających cząsteczek MHC klasy I. Efekt cytotoksyczny może być wywierany pośrednio lub za pośrednictwem przeciwciał. Bardzo ważnym elementem komórkowej odpowiedzi przeciwnowotworowej są limfocyty Th, czyli limfocyty pomocnicze. Limfocyty te mają na swej powierzchni najczęściej cząsteczki CD4 i rozpoznają prezentowany antygen w restrykcji MHC klasy II. W wyniku aktywacji limfocyty Th wydzielają cytokiny wspomagające lub hamujące komórki układu immunologicznego, tj. limfocyty B, limfocyty Tc, komórki NK, monocyty i makrofagi.

Odpowiedź immunologiczna dzieli się na odpowiedź Th1 i Th2 zależną [14-17]. Limfocyty typu Th1 i Th2 wydzielają odmienne profile cytokin. Limfocyty Th1 syntetyzują cytokiny sprzyjające odpowiedzi typu komórkowego, w tym również cytokiny wzmagające funkcję cytotoksyczną układu odpornościowego. Są to np. IL-2, IFN-g, IL-12, TNF-a, GM-CSF i inne. Limfocyty Th2 uwalniają cytokiny promujące humoralną odpowiedź immunologiczną, takie jak: IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, IL-18. Pomiędzy limfocytami Th1 i Th2 występuje zjawisko wzajemnej supresji aktywności, tak więc przy wzmożonej funkcji limfocytów Th2 odpowiedź komórkowa układu, w tym także funkcje przeciwnowotworowe są słabiej wyrażone [18].

Wielu autorów wskazuje na zaburzoną równowagę subpopulacji limfocytów Th1/Th2 u chorych na nowotwór, polegającą na przewadze aktywności komórek Th2 [19-23].

Następstwem tego zjawiska jest wzrost stężenia cytokin profilu Th2, co może sprzyjać rozwojowi nowotworu.

Ocena profilu cytokin wydzielanych w odpowiedzi immunologicznej u chorych na nowotwór może więc dostarczyć wielu cennych informacji i wyjaśnić niektóre wątpliwości związane z przeciwnowotworową funkcją układu odpornościowego.

Z uwagi na niedostatecznie rozpoznane mechanizmy przyczyniające się do osłabienia przeciwnowotworowej odpowiedzi komórkowej badania czynnościowe komórek, zwłaszcza limfocytów T oraz ocena profilu pronowotworowych i przeciwnowotworowych cytokin, wydają się celowe i uzasadnione.

Cele pracy

1. Ocena odpowiedzi proliferacyjnej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) u chorych na gruczolakoraka stercza.

2. Określenie profilu cytokin wydzielanych przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) po stymulacji przeciwciałami anty-CD3 w grupie chorych na gruczolakoraka stercza.

Materiał i metody

Grupa badana i grupa kontrolna

Badana grupa liczyła 14 mężczyzn z histopatologicznie rozpoznanym gruczolakorakiem stercza o złośliwości histologicznej G-1. Pacjenci przebywali w Samodzielnym Publicznym Szpitalu Klinicznym im. dr A. Jurasza w Bydgoszczy na oddziale urologii. Grupę kontrolną stanowiło 14 zdrowych mężczyzn z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Bydgoszczy. Badani pacjenci i dawcy krwi wyrazili pisemną zgodę na pobranie i wykorzystanie krwi do badań naukowych.

Materiał

Materiał do badań stanowiły komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), które izolowano z 20 ml krwi obwodowej dawców i z 10 ml krwi obwodowej pacjentów. Krew pobierano metodą próżniową z żyły łokciowej do probówek Vaccuette z heparyną sodową w ilości 14 jE/ml krwi (Medlab, Raszyn). Próbki były przechowywane w temperaturze pokojowej i przebadane w ciągu dwóch godzin od pobrania.

Izolacja komórek jednojądrzastych (PBMC) z krwi obwodowej

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) otrzymano metodą wirowania w gradiencie gęstości (LymphoprepTM, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegia), co zostało szczegółowo opisane wcześniej [24,25]. PBMC zawieszono w medium hodowlanym zawierającym RPMI-1640 (Biomed, Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Lublin) wzbogacone 5% płodowej surowicy cielęcej (Hungarpol, Budapeszt, Węgry) i gentamycyną (40 mg/ml). Uzyskana populacja komórek jednojądrzastych (PBMC) zawierała 85-90% limfocytów, 10-15% monocytów i 1-5% granulocytów. Liczbę komórek oznaczono przy użyciu komory Bürkera, a żywotność przy użyciu testu chłonięcia błękitu trypanu (żywotność komórek wyniosła >90%). Tak przygotowane PBMC stosowano do dalszych badań.

Ocena odpowiedzi proliferacyjnej PBMC

Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej zawieszano w medium hodowlanym w koncentracji 1 x 106/ml. Komórki umieszczano w dołkach płaskodennej mikropłytki hodowlanej firmy Corning, N. Y. USA (0,18 ml zawiesiny PBL, tj. 1,8 x105 komórek na dołek). Następnie do dołków płytki dodawano 0,02 ml RPMI-1640 lub 0,02 ml stymulatorów limfocytów T, tj. mysich przeciwciał monoklonalnych klasy IgG2a (BMA-030, Behringwerke, Marburg, Niemcy), swoistych dla receptora CD3 limfocytów T w różnych stężeniach (25-200 ng/ml). Hodowle prowadzono przez 72 godziny, w temperaturze 37oC, w atmosferze 90% wilgotności, zawierającej 95% powietrza i 5% CO2. Na 16 godzin przed zakończeniem hodowli do dołków płytki dodawano 0,5 ?Ci tymidyny znakowanej trytem (Amersham, Little Chalfont, UK). Każdą hodowlę prowadzono w trzech powtórzeniach. Po zakończonej inkubacji komórki zbierano na bibułę filtracyjną (Filter Mat, Skatron Instruments AS, Anglia) przy użyciu zbieracza komórek (Skatron, Oslo, Norwegia), bibułę suszono, a krążki bibuły zawierające wyznakowane trytem jądra komórkowe umieszczano w naczynkach zawierających płyn scyntylacyjny Opti-Scint (WallacOy, Turku, Finlandia). Pomiarów aktywności inkorporowanej do komórek tymidyny znakowanej trytem dokonywano przy użyciu licznika scyntylacyjnego BETAMIC V, Kontron Instruments.

Pomiar stężenia cytokin metodą immunoenzymatyczną ELISA

W celu oznaczenia poziomów cytokin (IFN-g, IL-10, IL-6, IL-12 i TNF-a) w nadsączach otrzymanych z 48-godzinnej hodowli limfocytów (1 x 106 komórek/ml) aktywowanych mysimi przeciwciałami monoklonalnymi klasy IgG2a, swoistymi dla receptora CD3 limfocytów T (200 ng/ml, BMA-30, Bchringwerke, Marburg, Niemcy) zastosowano technikę immunoenzymatyczną ELISA (zestawy OptEIATM firmy Becton Dickinson, San Diego, CA, USA), według instrukcji podanej przez producenta.

Analiza statystyczna wyników

Otrzymane wyniki zostały przedstawione jako wartości średnie ? odchylenia standardowe (xśr. ?SD). Statystyczną istotność różnic między wartościami średnimi obliczono przy pomocy testu U Manna-Whitneya i zdefiniowano jako parametr p. Poziom istotności został ustalony dla p Ł0,05. Powyższe parametry obliczono przy użyciu programu komputerowego Statistica 6.0 firmy Microsoft.

Wyniki

Proliferacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

Odpowiedź proliferacyjna jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3 (25-200 ng/ml) została oszacowana w dwóch grupach 14 chorych na gruczolakoraka stercza (grupa chorych) i 14 zdrowych dawców krwi (grupa kontrolna).

Maksymalna inkorporacja tymidyny znakowanej trytem nastąpiła po dwudniowej hodowli PBMC z przeciwciałami anty-CD3 w koncentracji 200 ng/ml (ryc 1). Reaktywność limfocytów T była znamiennie obniżona w grupie chorych na gruczolakoraka gruczołu krokowego (8905,7556 ?3805,933 cpm) w porównaniu do grupy osób zdrowych (13318,85 ?4026,507 cpm). Różnica była istotna statystycznie (p<0,05). Spontaniczna odpowiedź proliferacyjna PBMC była nieznacznie podwyższona u pacjentów (359,402 ?165,046 cpm) w porównaniu z grupą zdrowych dawców (194,376 ?70,193 cpm). Nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie między badanymi grupami (p> 0,05).

Poziomy cytokin produkowanych przez limfocyty i monocyty

Stężenia cytokin (IFN-g, TNF-a, IL-10, IL-12, IL-6) były mierzone w nadsączach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) po trzydniowej stymulacji stymulatorami limfocytów T, czyli przeciwciałami anty-CD3 (200 ng/ml).

Poziom IFN-g był obniżony w grupie osób chorych w porównaniu z grupą kontrolną (736,540 ?269,010 pg/ml, 915,900 ?89,305 pg/ml; ryc. 2). Wyniki nie były istotne statystyczne (p=0,062). Przeciwnie, poziom TNF-a nie różnił się statystycznie między grupą chorych na gruczolakoraka gruczołu krokowego a grupą zdrowych dawców (1075,210 ?79,220 pg/ml, 977,768 ?233,267 pg/ml; p=0,200; ryc. 3).

Nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie w wydzielaniu IL-10 w obu badanych grupach (530 ?135,600 pg/ml, 546,740 ?155,080 pg/ml; p=0,352; ryc. 4).

Poziom IL-12 w nadsączach hodowlanych PBMC wykazywał tendencję wzrostową w grupie chorych, jednakże bez różnic istotnych statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną (100,210 ?226,5596 pg/ml, 28,763 ?46,652 pg/ml, p=0,503; ryc. 5).

Ilość IL-6 wydzielanej przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej w odpowiedzi na stymulację przeciwciałami anty-CD3 nie różniła się znamiennie pomiędzy grupą pacjentów z gruczolakorakiem stercza a grupą kontrolną (413,599 ?149,080 pg/ml; 470,768 ?48,905 pg/ml; p=0,387). Stwierdzono podwyższone spontaniczne uwalnianie IL-6 w grupie chorych w porównaniu do grupy kontrolnej (55,88 ?28,179 pg/ml; 344,37 ?203,479 pg/ml; ryc. 6). Nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie (p=0,121).

Dyskusja

Reaktywność limfocytów i regulacja odpowiedzi typu Th1 i Th2 mają istotne znaczenie w odpowiedzi przeciwnowotworowej. Odpowiedź proliferacyjna limfocytów została oceniona na podstawie inkorporacji tymidyny znakowanej trytem przez proliferujące komórki. Poziom wydzielanych cytokin tj. IFN-g, TNF-a, IL-10, IL-12, i IL-6. w nadsączach hodowlanych PBMC (limfocyty, monocyty) oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej stymulowano przeciwciałami anty-CD3 przez okres trzech dni. Przeciwciało anty-CD3 jest znanym mitogenem limfocytów T, wzmaga proliferację, jest doskonałym induktorem wytwarzania i uwalniania IFN-g, TNF-a i IL-10 przez limfocyty T.

Komórki profilu Th1 produkują IFN-g, TNF-a, a komórki Th2 wydzielają IL-10 i IL-6 [8,15,16]. TNF-a jest wytwarzany przez różne komórki [1] przede wszystkim przez monocyty i makrofagi. Limfocyty CD4+ produkują niewielkie ilości TNF-a, a jego poziom wzrasta po stymulacji odpowiednim czynnikiem mitogennym. W naszych doświadczeniach wykorzystano przeciwciała anty-CD3, aby ocenić profil syntezy cytokin typu Th1 i Th2 w hodowlach komórkowych.

W grupie chorych na raka stercza wykazano obniżoną odpowiedź proliferacyjną komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Tendencja do obniżenia odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów T indukowanych przeciwciałami anty-CD3 w dawce supraoptymalnej dla proliferacji (200 ng/ml), prawdopodobnie zależy od zwiększenia oddziaływania komórek o funkcji supresyjnej, takich jak monocyty czy limfocyty T CD8+.

Badania prowadzone w naszym laboratorium wskazują na zaburzony profil wydzielania cytokin limfocytów Th1 i Th2. Stwierdzono obniżony poziom IFN-g- ważnej cytokiny typu Thl w grupie chorych na raka gruczołu krokowego w porównaniu z grupą zdrowych dawców krwi. Przeciwnie, koncentracja TNF-a była nieznacznie podwyższona w tej grupie chorych. Natomiast poziomy syntezy IL-10, IL-12 i IL-6 były porównywalne z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej.

Fillel X. i inni autorzy badali równowagę odpowiedzi typu Th1 i Th2 w hodowlach limfocytów krwi obwodowej u chorych na raka gruczołu krokowego [26]. Badacze oceniali ilości komórek produkujących cytokiny, takie jak IL-2, IFN-g, IL-10 i IL-4 po wcześniejszej stymulacji komórek estrem kwasu forbolowego (PMA) lub bez stymulatora przy użyciu techniki cytometrii przepływowej. Wykazali, że liczba komórek spontanicznie wytwarzających te cytokiny była nieznaczna. Jednak komórki stymulowane PMA wykazywały niższą niż w kontroli liczbę limfocytów zdolnych do syntezy zarówno IL-2 i IFN-g oraz podwyższoną liczbę komórek syntetyzujących IL-10. Pomimo odmiennego układu doświadczenia powyższe wyniki częściowo pokrywają się z naszymi obserwacjami dotyczącymi poziomu syntezy IFN-g. Dane te (łącznie z naszymi wynikami) wskazują na zablokowaną syntezę IFN-g w populacji PBMC uzyskanej od chorych na nowotwory gruczołu krokowego. Dwa typy komórek syntetyzują tę cytokinę: 1) limfocyty T (CD4+ typu Th1 oraz CD8+ cytotoksyczne), 2) limfocyty NK. Ponieważ poziom potencjalnych aktywatorów syntezy IFN-g, tj. TNF-a oraz IL-12 był nieznacznie podwyższony lub porównywalny z grupą kontrolną, należy sądzić, że dochodzi do zahamowania indukowanej tymi cytokinami produkcji IFN-g. Przyczyną tego mogą być: obniżona liczba komórek Th1 oraz NK (wytwarzają IFN-g, po kontakcie z IL-12 i TNF-a) i osłabiona odpowiedź tych komórek na te cytokiny. Obniżoną produkcję IFN-g przez PBMC u pacjentów chorych na nowotwory układu moczowo-płciowego zaobserwowało wielu badaczy [27]. Stwierdzono bowiem, że niskie stężenie IFN-g ułatwia rozwój nowotworu, obniża ilość antygenów MHC klasy I i II na komórkach zmienionych nowotworowo oraz zmniejsza ilość antygenów nowotworowych, co osłabia przeciwnowotworowe reakcje immunologiczne [28].

Stężenie TNF-a w hodowlach PBMC indukowanych przeciwciałami anty-CD3 było nieznacznie wzmożone w grupie chorych na gruczolakoraka stercza. Podwyższony poziom TNF-a u niektórych pacjentów może wynikać z nadreaktywności monocytów wywołanej prawdopodobnie ich interakcją z czynnikami nowotworowymi lub kompleksami immunologicznymi zawierającymi antygeny nowotworowe. Potwierdzeniem tego jest wysoki poziom IL-6 spontanicznie uwalnianej przez PBMC w badanej grupie chorych [7]. Wysoki poziom monokin tj. TNF-a oraz IL-12 (u niektórych pacjentów) w hodowlach PBMC indukowanych T-zależnym induktorem, tj. przeciwciałami CD3, reprezentuje prawdopodobnie reakcje układu odpornościowego na kontakt z antygenami nowotworowymi, w wyniku którego doszło do wyczerpania możliwości odpowiednio wysokiej syntezy IFN-g.

Nadmiar TNF-a w hodowlach indukowanych przeciwciałami anty-CD3 może zależeć od tendencji kompensacji niedoboru IFN-g, co stanowi ważny element odporności przeciwnowotworowej. Z drugiej strony jednak wielu autorów zwraca uwagę na obniżony poziom czynnika martwicy nowotworów w hodowlach PBMC pochodzących od podobnych chorych [21,27]. Układ doświadczeń stosowanych przez tych autorów jest różny od naszego, ponieważ używali oni LPS do stymulacji monocytów. LPS jest induktorem T-niezależnym, natomiast przeciwciała anty-CD3 są T-zależnym stymulatorem syntezy TNF-a. TNF-a pochodzący z PBMC aktywowanych przeciwciałami anty-CD3, pochodzi zarówno z monocytów, jak i limfocytów T. Natomiast LPS indukuje wyłącznie monocyty. TNF-a działa plejotropowo, reguluje proliferację, aktywację i różnicowanie wielu komórek, a także działa cytotoksycznie w stosunku do komórek nowotworowych [1,29], indukując w nich apoptozę [30]. Działanie przeciwnowotworowe TNF-a często zostaje obniżone poprzez liczne mutacje w genie kodującym ten czynnik. IFN-g produkowany przez pobudzone limfocyty Th1 aktywuje monocyty do wydzielania TNF-a. Badania donoszą, że TNF-a wraz z IL-12 również stymulują komórki NK do produkcji IFN-g [31]. Nasze badania sugerują zaburzone wydzielanie cytokin typu Th1. Zjawisko to może być związane z procesem nowotworzenia. W grupie badanej dochodzi do osłabienia odpowiedzi typu Th1 (niska synteza IFN-g) przy zachowaniu jednak prawidłowej odpowiedzi typu Th2 (poziom IL-10 prawidłowy). Obie odpowiedzi są istotne w walce z nowotworem. Wiadomo, że zmiany nowotworowe wpływają immunosupresyjnie na odpowiedź Th1 poprzez wydzielanie takich substancji jak TGF-b czy IL-10. Immunosupresja odzwierciedla się obniżoną syntezą niektórych cytokin istotnych w odpowiedzi przeciwnowotworowej. Spadek INF-g może być związany z hamującym działaniem IL-10, która jest inhibitorem odpowiedzi komórkowej wspieranej przez subpopulacje Th1. Zmniejszone wytwarzanie i uwalnianie INF-g u chorych z rakiem stercza częściowo wyjaśnia osłabioną odpowiedź komórkową, która jest uważana za skuteczną obronę przeciwnowotworową. Wysokie stężenie TNF-a nie chroni organizmu przed proliferacją komórek nowotworowych, ponieważ niektóre z nich nie są wrażliwe na tę cytokinę. Nasze doświadczenie sugeruje, że u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego może dochodzić do zaburzonej odpowiedzi typu Th1, tj. zmiany profilu wydzielanych cytokin, takich jak INF-g i TNF-a.

Równowaga między odpowiedzią Th1 a Th2 określana na podstawie wydzielanych cytokin przez poszczególne subpopulacje limfocytów może być skutecznym parametrem w ocenie procesów nowotworowych. Wzmaganie odpowiedzi typu Th1 uważa się za odpowiednie narzędzie w immunologii nowotworów oraz w monitorowaniu leczenia nowotworów.

Wnioski

1. Limfocyty T w badanej grupie chorych wykazywały obniżoną odpowiedź proliferacyjną na aktywację przeciwciałami anty-CD3, które mimifikują działanie antygenu w warunkach fizjologicznych.

2. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izolowane od chorych na gruczolakoraka stercza wykazują zmiany w profilach wydzielanych limfokin i monokin w porównaniu z grupą kontrolną.

3. Znaczący wzrost spontanicznej syntezy IL-6 w grupie osób chorych, niewykazujący dalszego wzrostu w wyniku stymulacji, wskazuje na możliwość indukcji syntezy tej cytokiny przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej pod wpływem antygenów nowotworowych.

4. Spadek poziomu IFN-g, przy prawidłowej syntezie IL-10, wskazuje na osłabienie reaktywności typu Th1 zależnej od IFN-g i niezmienionej odpowiedzi typu Th2 w badanym procesie chorobowym.

piśmiennictwo

  1. Lutz W, Tarkowski M: Układ odpornościowy w chorobach nowotworowych; w Lutz W, Tarkowski M: Znaczenie i diagnostyka układu odpornościowego w chorobach nowotworowych. Łódź, IMP im. prof. J. Nofera, 2001, str. 48-85
  2. Pawelec G: Tumor escape from the immune response. Cancer Immunol Immunother 2004; 53; 843
  3. Yang L, Carbone DP: Tumor-host immune interactions and dendritic cell dysfunction. Adv Cancer Res 2004; 92; 13-27.
  4. Piemonti L, Zerbi A, Di Carlo V: Strategies for tumor immune escape. Drugs Today (Barc); 2003; 39; 701-724.
  5. Gabrilovich D, Pisarev V: Tumor escape from immune response: mechanisms and targets of activity. Curr Drug Targets 2003; 4: 525-536.
  6. Bander MH, Yao D, Liu H et al: MHC class I and MHC class II expression in prostate cancer and modulation by interferon-alfa and gamma. Prostate 2000; 33; 1997-1999.
  7. Kavanaugh DY, Carbone DP: Immunologic dysfunction in cancer. Hematology/oncology clinics of North America 1996; 20; 927-949.
  8. Łącki JK, Wiktorowicz KE: Biologiczne właściwości interleukiny 10. Post Hig Med Dośw 1994; 48; 363-370.
  9. Yu L, Wu Y, Hui Y et al Expression of IL-4 and IL-10 by PBMC and tumor tissue in cancer patients. Zhogguo Yi Xoe Ke Xue Yuan Xue Bao 1997; 19; 227-231.
  10. Shurin GV, Aalamian M, Pirtshalaishvili G et al: Human prostate cancer blocks the generation of dendritic cells from CD34+ hematopoetic progrenitors. Eur Urol 2001; 39; 37-40.
  11. Aalamian M, Tourkova IL, Chatta GS et al: Inhibition of dendropoesis by tumor derived and purified prostate specific antigen. Urol 2003; 170; 2026-2030.
  12. Oh BR, Sasaki M, Perinchery G et al: Frequent genotype changes at 308 and 488 regions of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) gene in patients with prostate cancer. J Urol 2000; 163; 1584-1587.
  13. Kennedy-Smith AG, McKenzie JL, Owen MC et al: Prostate specific antigen inhibits immune responses in vitro: a potential role in prostate cancer. J Urol 2002; 168; 741-747.
  14. Romagnani S: Biology of human TH1 and TH2 cells. J Clin Immunol 1995 May; 15; 121-129.
  15. Picker LJ, Singh MK et al: Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effectory T cells by flow cytometry. Blood 1995; 86; 1408-1419.
  16. Abbas AK, Murphy KM, Sher A: Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 1996; 383; 787-793.
  17. Romagnani S, Parronchi P, D?Elios MM et al: An update on human Th1 and Th2 cells. Int Arch Allergy Immunol 1997; 113; 153-156.
  18. Oriss TB, McCarthy SA, Morel BF et al: Crossregulation between T helper cell (Th) 1 and Th2: inhibition of Th2 proliferation by IFN-gamma involves interference with IL-1. J Immunol 1997; 15; 158 (8); 3666-3672.
  19. Steffen J: Interleukiny i ich receptory w nowotworach u ludzi: synteza, uwalnianie, występowanie w surowicy krwi. Diag Lab 1994; 30; 221-240.
  20. Sato M, Goto S, Kaneko R et al: Impaired production of Th1 cytokines and increased frequency of Th2 subsets in PBMC from advanced cancer patients. Anticancer Res 1998; 18: 3951-3955.
  21. Elsasser-Beile U, Kolble N Grussenmeyer T et al: Th1 and Th2 cytokine response patterns in leukocyte cultures of patients with urinary bladder, renal cell and prostate carcinomas. Tumor Biol 1998, 19; 470-476.
  22. Kamińska J, Kowalska M, Rysińska A et al: Cytokiny w surowicy krwi u chorych na nowotwory złośliwe. Nowotwory 1999; 49; 21-25.
  23. Morris MJ, Scher HI: Novel strategies and therapeutics for the treatment of prostate carcinoma. Cancer 2000; 89: 1329-1348.
  24. Michałkiewicz J, Stachowski J, Barth C et al: Effect of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A on IFN-g synthesis: expression of costimulatory molecules on monocytes and activity of NK cell. Immunolo Lett 1999; 69; 359-366.
  25. Socha P, Michałkiewicz J, Stachowski J et al: Deficiency of the expression of CD45RA isoform of CD45 common leucocyte antigen in CD4+ T lymphocytes in children with infantile cholestasis. Immunolo Lett 2001; 75; 179-184.
  26. Filell X, Alcover J, Zarco MA et al: Analysis of type Th1 and Th2 cytokines in patients with prostate cancer. Prostate 2000; 44; 271-274.
  27. Shigenori G, Manami S, Ryuta K et al: Analysis of Th1 and Th2 cytokine production by peripheral blood mononuc1ear cell s as a parameter of immunological dysfuncion in advanced cancer patient. Cancer Immunol Immunother 1999; 48; 435-442.
  28. Akimoto S, Okumara A, Fuse H: Relationship between serum levels of interleukina-6, tumor necrosis factor-alpha and bone turnover markers in prostate cancer patients. Endocr J 1998; 45; 183-189.
  29. Chang Nan-Shan: Hyaluronidase enhancement of TNF-mediated cell death is reversed by TGF-b. Am J Physiol 1997; 273; 1987-1994.
  30. Muenchen HJ, Lin DL, Walson MA et al: Tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in prostate cancer cells through inhibition of nuclear factor-kappab by kappaâá-super repressor. Clin Cancer Res 2000; 6; 1969-1977.
  31. Belardelli F: Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response. APMIS 1995; 103; 161-179.

adres autorów

Anna Helmin-Basa
Zakład Immunologii Collegium Medicum
ul. Skłodowskiej-Curie 9
85-094 Bydgoszcz
tel. (052) 585 34 73
annahelmin@o2.pl