PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

BADANIE AKTYWNOŚCI ANGIOGENNEJ RAKA NERKI NA MODELU SKÓRNEJ ANGIOGENEZY IN VIVO
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2000/53/1.

autorzy

Krzysztof Pastewka 1, Ewa Skopińska-Różewska 2, Ewa Sommer 2, Mirosław Kazoń 1, Andrzej Borówka 1
1 Klinika Urologii CMKP w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. med. A. Borówka
2 Zakład Immunologii IGiCHP w Warszawie
Kierownik: prof, dr hab. med. E. Skopińska-Różewska

słowa kluczowe

nerka rak nerki karcinogeneza angiogeneza

streszczenie

Materiał i metoda. Celem pracy było określenie pobudzenia angiogennego
w testach skórnych w wyniku szczepienia materiałem pochodzącym z raka
nerki. Przebadano zdolność neoangiogenną 15 przypadków raka miąższu
nerki, szczepiąc komórkami raka nerki myszy wsobne typu BALB/C (wyko-
nano 230 testów angiogenezy skórnej in vivo). Liczbę powstałych w wyniku
angiogenezy naczyń spełniających kryteria neokapilar (wg Sidky, Auerba-
cha) porównano z wynikami dwóch grup kontrolnych: A-myszy szczepione
płynem fizjologicznym Parkera (angiogeneza urazowa), B-myszy szczepio-
ne homogenatami zdrowego makroskopowo miąższu nerki.
Wyniki. W badanej grupie uzyskano znamiennie wyższą liczbę naczyń, śred-
nio 14,4, w porównaniu z grupami kontrolnymi A i B odpowiednio 3,22 i 8,6.
Wnioski. Uzyskane wyniki świadczą o wysokiej aktywności angiogennej raka
nerki w porównaniu z grupami kontrolnymi. Przedstawiono obrazy powsta-
łych naczyń krwionośnych na zdjęciach mikroskopowych.

Angiogenezy (neowaskularyzacja) jest to zdolność tworzenia nowych
naczyń krwionośnych na bazie już istniejących. Uważa się ją za jeden z
głównych czynników decydujących o równowadze między proliferacją,
czyli przyrostem masy komórkowej, a apoptozą czyli fizjologiczną śmier-
cią komórki [17]. Nowo powstające naczynia obserwuje się zwłaszcza w
tkankach proliferujących i naciekających [7,8,15]. Jest bardzo prawdopo-
dobne, iż neowaskularyzacja decyduje o rozwoju i szerzeniu się procesu
rozrostowego, gdyż poprzez jej zahamowanie udało się w badaniach do-
świadczalnych ograniczyć przyrost masy nowotworowej [4, 5,10]. Doty-
czy to również raka nerki, którego rozwój silnie hamuje angiostatyna i
endostatyna – pochodne plazminogenu i kolagenu, odkryte w Bostonie
na początku lat dziewięćdziesiątych [16,17]. W raku miąższu nerki miej-
scem o silnej aktywności angiogennej jest obwodowa część guza. W czę-
ści centralnej dochodzi niekiedy do rozpadu i martwicy. Pomimo licz-
nych badań nie została zdefiniowana aktywność angiogenna tego
nowotworu. Określa się ją w sposób statyczny i dynamiczny. Pierwszy
polega na obliczaniu gęstości naczyniowej (microvessel density ? MVD)
określając liczbę naczyń w jednostce objętości tkanki. Badania te prze-
prowadza się z zastosowaniem metod immunohistochemicznych, w raku
nerki najczęściej przeciwciał CD31 lub Ki-67, dzięki którym można uwi-
docznić elementy śródbłonka (białka endotelium) [13]. Metody staty-
styczne pozwalają obliczyć przeciętną liczbę kapilar w raku jasnokomór-
kowym nerki, która wynosi 30-60 naczyń na mm3 w powiększeniu
200-krotnym [21]. Istnieją rozbieżne dane odnoszące się do roli progno-
stycznej tych pomiarów. Teza Folkmana [8, 20, 21] o prostej zależności
między stopniem zaawansowania guza, obecnością przerzutów a gęsto-
ścią naczyniową ostatnio jest podważana na podstawie prac nie wyka-
zujących żadnej korelacji [14], a nawet sygnalizujących korelację ujemną
[12]. Powodem tych rozbieżności jest prawdopodobnie zróżnicowany
proces proliferacyjny w obrębie tego samego guza oraz różnorodność
typów histologicznych rozpatrywanych guzów nerki. W Polsce badania
siatki naczyniowej raka jasnokomórkowego nerki przeprowadzał Bu-
gajski [6], a jego prace nadal kontynuowane są w Klinice Urologii UJ.
Innym sposobem badania aktywności angiogennej jest doświadczalna
obserwacja dynamiki tworzenia się naczyń po wszczepieniu komórek
nowotworowych lub tkanek raka w podłoże fizjologiczne. Angiogenezę
wywołuje się in vivo na modelach skórnych, błonach kosmówkowych za-
rodka kurzego, rogówkach, lub in vitro na żelach fizjologicznych [1,11].
Nowo wytworzone naczynia krwionośne identyfikowane są na podsta-
wie kryteriów podanych przez Sidky’ego i Auerbacha z roku 1975 (tabe-
la 1) [2]. Dynamika tworzenia naczyń jest odzwierciedleniem zdolności
angiogennej badanej tkanki. Ten model wywoływania angiogenezy słu-
ży również do poszukiwania czynników modulujących waskularyzację
[9,10,16-19]. Na przykład, po określeniu reakcji angiogennej nowotwo-
ru badany jest następnie wpływ substancji endo- i egzogennych hamu-
jących lub pobudzających neowaskularyzację. W raku nerki brak jest jesz-
cze badań dynamicznych angiogenezy. Od 2 lat badania dynamiki
tworzenia naczyń w raku nerki przeprowadzane są w Zakładzie Immu-
nologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie we współpracy z
Kliniką Urologii CMKP. Badania dotyczą aktywności angiogennej. Po-
szukuje się również modulatorów angiogenezy.
Autorzy pracy wybrali model angiogenezy skórnej in vivo, aby doświad-
czalnie zbadać dynamikę tworzenia naczyń krwionośnych w raku nerki,
porównując wyniki z dwiema grupami kontrolnymi. Pierwszą (A) stano-
wiły myszy szczepione płynem fizjologicznym Parkera, drugą (B) myszy
po zaszczepieniu materiałem pochodzącym z makroskopowo nie zmie-
nionych fragmentów operowanej nerki. Uzyskany model doświadczalnej
angiogenezy stanowi podstawę badań nad modulatorami angiogenezy.
Celem pracy było określenie współczynnika pobudzenia angiogene-
zy w testach skórnych w wyniku szczepienia materiałem nowotworo-
wym pochodzącym z raka jasnokomórkowego miąższu nerki.
MATERIAŁ I METODA
Uzyskano fragmenty tkankowe z obwodowej części guza nerki od 25
pacjentów operowanych w 1998 roku w Klinice Urologii CMKP z powo-
du guza nerki. Do analizy wyselekcjonowano 15 przypadków raka ja-
snokomórkowego o tym samym typie histologicznym (ca. clarocellulare).
Z analizy wyłączono jeden przypadek angiomyolipoma, 4 przypadki gu-
zów o typie papillarnym oraz 5 o typie miesznym. Stopień zaawanso-
wania i zróżnicowania, a. także typy histologiczne przedstawiono w ta-
beli 2, Najczęściej występował guz T2G2 typ jasnokomórkowy. Komórki
nowotworowe izolowano za pomocą reakcji enzymatycznej z kolagena-
zą i DNA-azą w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
W celu wywołania angiogenezy podawano śródskórnie myszom wsob-
nym Balb/C przeciętnie 5×106 komórek nowotworowych w 0,05 ml za-
wiesiny tkankowej.
Homogenaty (zawiesiny tkankowe guzów lub tkanki nerki) uzyskiwa-
no porzez sonifikację (działanie ultradźwięków) badanego materiału, któ-
rymi szczepiono śródskórnie w ilości 0,05 ml myszy wsobne typu Balb/C
znieczulone dootrzewnowo roztworem 3,6% wodzianu chloralu, wywo-
łując reakcję angiogenną. Wynik odczytywano w trzeciej dobie (72 godzi-
ny) pod mikroskopem optycznym operacyjnym (SMR 10-A Nikkon) w
powiększeniu 32-krotnym po uprzednim uśpieniu myszy letalną dawką
wodzianu chloralu (0,5 ml na mysz). Za nowe kapilary uznawano te na-
czynia, które spełniały kryteria Auerbacha i Sydke (tabela 1). Test angio-
genezy wywoływany komórkami pojedynczego guza powtarzano śred-
nio 6-10 razy u jednej lub dwóch myszy, w zależności od ilości uzyskanego
materiału. Uzyskane wyniki, odczytywane przez tę samą osobę, uśred-
niano. W grupie badanej wykonano 120 testów angiogenezy.
W grupie kontrolnej A oceniono 56 testów angiogenezy urazowej,
szczepiąc myszy płynem fizjologicznym Parkera. Wywoływano tym sa-
mym tzw. angiogenezę urazową.
Grupę kontrolną B stanowiło 24 testów angiogenezy, którym wszcze-
piono materiał tkankowy uzyskany z nie zmienionych makroskopowo
fragmentów usuniętych z powodu guza 3 nerek. Ilość materiału oraz
metodologia była identyczna, jak w przypadku grupy badanej. Odczyt
wyników angiogenezy w grupach kontrolnych odbywał się według tych
samych kryteriów, jak w grupie badanej.
WYNIKI
W grupie badanej testy angiogenezy wykonano komórkami raka miąż-
szu nerki w ilości 5×106 w 0,05 ml wyizolowanymi z 15 guzów typu
Carcinoma clarocellulare od 8 kobiet i 7 mężczyzn. Średni wiek chorych w
grupie badanej wynosił 62 lata. Średnia wielkość guza wynosiła 6,73 cm.
Łącznie wykonano 120 testów angiogenezy i porównano z 56 testami
angiogenezy urazowej wywołanej płynem fizjologicznym Parkera.
Jenocześnie porównano 24 testy angiogenezy wywołanej homoge-
natami prawidłowego miąższu nerki z taką samą ilością testów angio-
genezy homogenatów guzów nerek. W tym zestawieniu konieczność
badania homogenatów guzów i nerek była podyktowana trudnościa-
mi, jakie napotkano w izolowaniu komórek prawidłowej nerki metodą
enzymatyczną.
W grupie badanej po 72 godzinach od podania podskórnego komórek
raka miąższu nerki obliczona liczba nowych naczyń krwionośnych wy-
nosiła średnio 14,4. Poszczególne wyniki przedstawiono w tabelach II i
III, pomijając dane dotyczące odchyleń standardowych oraz wartości eks-
tremalnych.
W grupie kontrolnej A (angiogeneza urazowa) wykonano 56 testów
angiogenezy, podając śródskórnie płyn fizjologiczny Parkera. Średni
wynik aktywności angiogennej (liczba wytworzonych naczyń krwiono-
śnych) wynosiła 3,22. Wskaźnik pobudzenia angiogenezy, czyli stosu-
nek obu wyników, wyniósł Wp = 4,47.
Porównując wzbudzenie angiogenezy po podaniu homogenatów raka
nerki z tkankami miąższu nerki pobranych z miejsc niezmienionych ma-
kroskopowo uzyskano wyniki przedstawione w tabeli III.
W grupie kontrolnej B liczba naczyń wytworzonych w testach skórnej
angiogenezy była w każdym z trzech badanych guzów mniejsza w od
ich liczby w testach angiogenezy spowodowanej szczepieniem homoge-
natami tkanki guza. Wskaźnik pobudzenia wyniósł 1,63. Sumaryczne
rezultaty przedstawia wykres (ryc. 1).
OMÓWIENIE WYNIKÓW
W badaniach wcześniejszych nad angiogenezą dynamicznie prowo-
kowano ją w testach skórnych in vivo erytrocytami ludzkimi uzyskując
pobudzenie średnio 6,8 naczyń krwionośnych wokół wstrzyknięcia po
72 godzinach (32 testy angiogenezy wykonane przez Skopińską-Różew-
ską i Kamińskiego z Zakładu Immunologii IGiCHP).
W naszym badaniu grupę kontrolną stanowiła angiogenezą urazowa
na skutek podania podskórnego płynu elektrolitowego Parkera (śred-
nio 3,22 nowe naczynia krwionośne), oraz angiogenezą wywołana ho-
mogenatami tkanki miąższu nerki nie zmienionej makroskopowo (8,6
nowych naczyń krwionośnych).
Średnio po 72 godzinach obsewacji od podania podskórnego komórek
raka nerki lub homogenatów powstało około 14 nowych naczyń krwio-
nośnych. Wynik w.grupach badanych był znamiennie wyższy od uzyska-
nych rezultatów w obu grupach kontrolnych, co świadczy o różnicy w
aktywności angiogennej podawanych substancji. Określono współczyn-
niki pobudzenia angiogenezy. W pierwszej grupie porównawczej wyniósł
4,47, a w drugiej 1,63. Pobudzenie angiogenezy jest szczególnie wyraźne
w porównaniu z grupą kontrolną A, w której wywoływano angiogenezę
płynem Parkera. Aby wyniki były porównywalne pod względem mate-
riału wywołującego angiogenezę utworzono grupę kontrolną B (homoge-
naty z materiału tkankowego pochodzącego z miąższu nerki niezmienio-
nej makroskopowo). Autorzy zdają sobie sprawę, że badany prawidłowy
makroskopowo fragment miąższu nerki pochodzący z usuniętego śródo-
peracyjnie preparatu, w którym znajduje się guz nowotworowy, nie jest
doskonałym modelem porównawczym. Wyniki uzyskane z trzech kolej-
nych guzów nerek i jednocześnie fragmentów prawidłowej tkanki wska-
zywały w każdym przypadku na podobną różnicę w aktywności angio-
gennej (Wp > 1,5). Nie zaobserwowano większych różnic aktywności an-
giogennej badanych guzów w zależności od stopnia zaawansowania, wiel-
kości guza, płci. Grupa badanych guzów była jednakowa pod względem
typu histologicznego oraz stopnia zróżnicowania (G2) i być może to było
powodem podobnej reakcji w aktywności angiogennej.
KOMENTARZ
W pracy przedstawiono dynamiczny sposób badania aktywności an-
giogennej homogenatów raka nerki. Oprócz metody skórnej angiogene-
zy przeprowadzonej w badaniu istnieją inne modele badania angioge-
nezy (test rogówkowy, błona kosmówkową zarodka kurzego, żele
fizjologiczne) [1, 2, 11]. Wybór skórnej angiogenezy stanowi, zdaniem
autorów najbardziej zbliżony model miejscowej progresji nowotworo-
wej. W podłożu fizjologicznym, jakim jest tkanka podskórna, trudniej
jest jednak policzyć powstałe naczynia, gdyż należy wyeliminować fi-
zjologiczne kapilary istniejące w tkance. Dlatego odczytu dokonywała
ta sama osoba, która zliczała kapilary spełniające kryteria Sidky i Auer-
bacha (tabela I). W roku 1998 w Zakładzie Immunologii IGiCHP w War-
szawie opracowano komputerową metodę analizy obrazu mikroskopo-
wego ułatwiającą obiektywizację wyników [3]. Metody tej nie stosowano
jednak w przedstawionej pracy.
W naszej pracy stwierdzono podwyższoną zdolność tworzenia naczyń
przez komórki i homogenaty raka nerki w testach skórnej angiogenezy.
Z badań innych autorów, a także naszych, które są w toku wynika, iż za
aktywność angiogenną w raku nerki odpowiedzialne są cytokiny endo-
genne, a w szczególności VEGF (uascular endothelial growth factor), oraz
BFGF (basic fibroblast growth factor). Określenie aktywności angiogennej
raka nerki umożliwia w następnej kolejności prowadzenie badań nad
wpływem czynników egzogennych (leków) i endogennych (inhibitory
angiogenezy ? cytokiny) na zdolność wytwarzania naczyń. Obecnie w
Zakładzie Immunologii IGiCHP przeprowadzane są badania nad wpły-
wem niesterydowych leków przeciwzapalnych (aspiryna, piroxicam) [9,
10,13,16-19].
WNIOSKI
Test skórnej angiogenezy in vivo umożliwia przeprowadzenie dynamicz-
nej analizy aktywności angiogennej raka nerki. Po 72 godzinach od
wstrzyknięcia komórek raka nerki, wyizolowanych metodą enzymatycz-
ną lub homogenatów raka jasnokomórkowego nerki uzyskanych metodą
sonifikacji, uzyskano przeciętnie 14 nowych kapilar. Liczba nowych kapi-
lar była wyższa niż w grupach kontrolnych. Współczynnik pobudzenia
w porównaniu z angiogenezą urazową wywołaną fizjologicznym płynem
Parkera wyniósł 4,48, a współczynnik pobudzenia homogenatów guza
nerki i nie zmienionego miąższu nerki wyniósł 1,63. Nie zaobserwowano
różnic aktywności angiogennej w zależności od stopnia zaawansowania
raka nerki. Wyniki uzyskane w pracy mogą posłużyć do dalszych badań
w celu poszukiwania modulatorów waskularyzacji.

piśmiennictwo

  1. [1] Andrade, S. P., Fan, T. P., Lewis, G. P.: Quantitative in vivo studio on
  2. angiogenesis in a rat sponge model. Br. J. Exp. Pathol. 1987, 68, 755-766.
  3. [2] Auerbach, Sidky: Lymphocyte induced angiogenesis, a quantitative and sensi-
  4. tive assay by modified assay of the graft versus host reaction. J. Exp. Med. 1975,
  5. 141, 1084-1100.
  6. [3] Bałan, B., Skopińska-Różewska, E., Kukiełka, G., Domański, J.: Próba
  7. zastosowania cyfrowych metod analizy i przetwarzania obrazów do oceny proce-
  8. sów angiogenezy indukowanej komórkami ludzkich nowotworów na modelu
  9. zwierzęcym. III Symp. Nauk. Technika Przetwarzania Obrazu. Politechnika
  10. Warszawska, 1997.
  11. [4] Bochner, B. H., Windham, C. Q., Pao, M. M., Kasahara, N., Skinner,
  12. D. G., Jones, P. A.: Overexpression of trombospondin-1 inhibits bladder tumor
  13. growth: a novel therapy for invasive bladder cancer. J. Urol. 1998,159, 282.
  14. [5] Borgstrom, P., Bourdon, M. A., Hillan, K. J., Sriramaro, R, Ferrara,
  15. N.: Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody completely in-
  16. hibits angiogenesis and growth of human prostate carcinoma microtumors in vivo.
  17. Prostate 1998, 35,1-10.
  18. [6] Bugajski, A.: System naczyniowy guza, wielkość i lokalizacja jako czynnik pro-
  19. gnostyczny raka nerki. Urol. Pol. 1994, 47, 12-22.
  20. [7] Campbell, S. C: Northwestern Univ. Med. Sch. Chicago II, USA. Adranceas
  21. in angiogenesis research: relevance to urological Oncology (review). J. Urol. 1997,
  22. 158, 1663-1674.
  23. [8] Folkmann, J.: Angiogenesis in cancer, vascular and rheumatoid and other dise-
  24. ase. Nature Med. 1995,1, 27-31.
  25. [9] Folkmann, J., Langer, R. et al.: Angiogenesis inhibition and tumor regres-
  26. sion caused by heparin or heparin fragment in the presence of cortisone. Science
  27. 1983, 221, 719-725.
  28. [10] Fujioka, T., Hasegawa., M., Ogiju, K., Matsushita, Y., Sato, M., Kubo, T.:
  29. Antitumor effects of angiogenesis inhibitor fumagillol (TNP-470) against murine
  30. renal cell carcinoma. Brit. J. Urol. 1994, 74, 416-421.
  31. [11] Gimbrone, M., Cotran, R., Leapman, S., Folkman, J.; Tumor growth and
  32. neovascularization: an eiperimental model using the rabbit cornea. J. Natl. Can-
  33. cer Inst. 1974, 5, 413-427.
  34. [12] Herbst, C, Kosmehl, H., Stiller, K. J., Bernardt, A., Eiselt, M., Schu-
  35. bert, J.: "Evaluation of microvessel density by Computerized image analysis in
  36. human renall cell carcinoma - correlation to pT category, nuclear grade, prolifera-
  37. tive actwity and occurrence of metastasis. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1998,124,
  38. 141-147.
  39. [13] Jones, A., Fujiyama, C: Angiogenesis in urological malignancy. Prognostic
  40. indicator and therapeutic target. B. J. Urology International 1999, 83, 535-556.
  41. [14] MacLenan, G. T., Bostick, D. G.: Microvessel density in renal cell carcino-
  42. ma. Lack of prognostic significance. Urology 1995, 46, 27-30.
  43. [15] Nativ, O:; Sabo, E., Reiss, A., Wald, M., Madjar, S., Moskovitz, B.:
  44. Clinical significance of tumor angiogenesis in patients with localized renal cell
  45. carcinoma. Urology 1998, 51, 693-696.
  46. [16] O'Reilly, M. S., Boehem, T., Shing, Y., Fukai, N., Vasios, G., Lane, W.
  47. S., Flynn, E., Birkhead, J. R., Olsen, B. R., Folkman, J.: Endostatin: an
  48. endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997, 88, 277-285.
  49. [17] O'Reilly, M. S., Holmgren, L., Chen, C. C, Folkman, J.: Angiostatin
  50. induces and sustains dormancy of human primary tumors in mince. Nature Med.
  51. 1996, 2, 689-692.
  52. [18] Skopińska-Różewska, E., Sommer, E., Pastewka, K., Barcz, E., Ka-
  53. zoń, M., Białas-Chromiec, B., Bałan, B., Przybyszewska, M., Janik,
  54. P.: Inhibitory effect of the obromine on angiogenic activity of human kidney and
  55. bladder cancer cells. Int. J. Molecular Med. 1998 (w druku).
  56. [19] Sommer, E., Skopińska-Różewska, E.: Anty'nowotworowe działanie nieste-
  57. rydowych leków przeciwzapalnych ze szczególnym uwzględnieniem sulindaku.
  58. Terapia 7, 1998.
  59. [20] Weidner, N.: Intratumoral vasculańty as a prognostic factor in cancers of the
  60. urogenital tract. Eur. J. Cancer 1996, 32A, 2506-2512.
  61. [21] Yoshino, S., Kato, M., Okada, K.: Pognostic significance of micmuessel co-
  62. unt in low stage renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 1995, 2, 156-160.