PTU - Polskie Towarzystwo Urologiczne

Uzupełnienie w warunkach doświadczalnych ubytku ściany pęcherza moczowego wszczepem wytworzonym metodą inżynierii tkankowej
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 2004/57/4.

autorzy

Tomasz Drewa 1,2, Zbigniew Wolski 1, Przemysław Gałązka 2, Bartosz Misterek 1, Joanna Drewa 3, Sylwia Drewa 4, Jan Sir 5
1 Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej w Bydgoszczy
Kierownik kliniki: prof. dr hab. Zbigniew Wolski
2 Katedra i Zakład Biologii Medycznej Akademii Medycznej w Bydgoszczy
Kierownik zakładu: prof. dr hab. Gerard Drewa
3 Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej, Centrum Onkologii w Bydgoszczy
Kierownik zakładu: dr n. med. Jadwiga Szabo-Moskal
4 Katedra i Zakład Radiologii i Diagnostyki Obrazowej Akademii Medycznej w Bydgoszczy
Kierownik zakładu: prof. dr hab. Władysław Lasek
5 Zakład Patologii Nowotworów, Centrum Onkologii w Bydgoszczy
Kierownik zakładu: lek. Jan Sir

słowa kluczowe

augmentacja pęcherza, inżynieria tkankowa

streszczenie

wprowadzenie i cel pracy
Inżynieria tkankowa daje możliwość przygotowania przeszczepu tkankowego zbudowanego in vitro z komórek osadzonych na biowchłanialnym rusztowaniu przestrzennym.
Oceniono funkcjonowanie płata utworzonego metodami inżynierii tkankowej, wykorzystanego do plastyki pęcherza moczowego w modelu zwierzęcym. Praca została wykonana po uzyskaniu zgody Lokalnej Komisji Etyki do Badań nad Zwierzętami w Bydgoszczy (nr zgody 5/04 z dn. 1.03.2004).
materiał i metody
Hodowla komórek: mysie fibroblasty linii 3T3 w liczbie 108 hodowano na podłożu DMEM wzbogaconym 10% surowicą płodową wołową i antybiotykami w atmosferze o podwyższonej wilgotności i zawierającej 5% CO2. Po tygodniu hodowli w warstwie, komórki wysiano na konstrukcję z włókien kwasu poliglikolowego (PGA) ulegającą wchłanianiu. Zwierzęta: sześć młodych szczurów, którym wycięto część pęcherza moczowego i wytworzono przetokę nadłonową. Ubytek pęcherza uzupełniono wyhodowanym płatem przygotowanym in vitro. Trzy zwierzęta uśpiono po tygodniu. U trzech kolejnych po dwóch tygodniach wykonano USG po usunięciu cystostomii. Zwierzęta z tej grupy uśpiono po miesiącu. Przed uśpieniem wykonywano cystografię. Do doświadczenia użyto dwóch grup kontrolnych. W pierwszej z nich zwierzętom wykonywano częściową cystektomię. Drugą grupę kontrolną stanowiły zdrowe szczury. Ścianę pęcherzy, które poddano plastyce, oceniono, wykonując preparaty histologiczne barwione hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemiczne (przeciwko czynnikowi von Willebrandta i przeciwko glikoproteinom CD31 i CD34).
wyniki
Przebieg pooperacyjny był niepowikłany u wszystkich zwierząt. Pojemność pęcherzy poddanych plastyce była porównywalna do prawidłowego pęcherza moczowego szczura. Badanie mikroskopowe wykazało obecność przerośniętego fibroblastami rusztowania PGA zespolonego z mięśniówką pęcherza. Stwierdzano obecność naczyń krwionośnych w obrębie płata wszczepionego w ścianę pęcherza. Nie obserwowano cech reakcji zapalnej w obrębie ściany pęcherza moczowego poddanego plastyce.
wnioski
Płat otrzymany metodą inżynierii tkankowej może mieć zastosowanie do uzupełniania ubytku ściany pęcherza moczowego.

Wprowadzenie

W chirurgii rekonstrukcyjnej dróg moczowych wykorzystuje się materiał autologiczny, pozyskiwany najczęściej ze ściany przewodu pokarmowego [1]. Zastosowanie fragmentów przewodu pokarmowego w rekonstrukcji pęcherza moczowego wiąże się z pewnym odsetkiem powikłań [2,3,4,5]. Od dawna prowadzono prace nad wykorzystaniem do tego celu materiałów autologicznych lub ksenogenicznych [6]. Zastosowanie wszczepów utworzonych in vitro z autologicznych komórek powinno zminimalizować powikłania występujące w przypadku stosowania jelita do rekonstrukcji dróg moczowych.

Ostatnie dziesięciolecie ubiegłego wieku wiąże się z szybkim rozwojem technik inżynierii tkankowej. Metody stosowane w inżynierii tkankowej pozwalają konstruować tkanki poza organizmem (in vitro), a następnie przeszczepiać je w miejsca uszkodzeń, uzupełniając brakujące bądź nieprawidłowe tkanki. Budowanie tkanek in vitro polega na wysiewaniu komórek na podłoża ulegające biodegradacji. Konstrukcja taka zostaje następnie przeszczepiona. Matryca, na której hodowane są komórki ulega zanikowi ustępując powoli miejsca rosnącej de novo tkance [7].

Postępy w metodach hodowli komórek nie rozwiązały problemów związanych z wprowadzeniem inżynierii tkankowej do praktyki klinicznej. Izolacja i otrzymanie ogromnej liczby komórek potrzebnych do wykonania przeszczepu wiąże się m.in. z wysokimi kosztami. Nie znaleziono równie ż idealnego materiału, mogącego służyć jako rusztowanie dla hodowanych komórek. Polimery, które stosuje się obecnie w pracach eksperymentalnych nadal są udoskonalane [8]. Wiele doniesień dotyczących rekonstrukcji dróg moczowych przy użyciu technik inżynierii tkankowej wykorzystuje bezkomórkowe podłoża, często ksenogeniczne, na które wysiewane są komórki autologiczne [9].

Cel pracy

Celem pracy jest ocena możliwości zastosowania wszczepu wytworzonego in vitro do uzupełnienia ubytku w ścianie pęcherza moczowego.

Materiał i metody

Hodowla komórek. Mysie fibroblasty linii 3T3 namno żono do całkowitej liczby 108 komórek. Hodowlę prowadzono na podłożu DMEM (Dulbecco Modified Essential Medium, Sigma-Aldrich) wzbogaconym 10% surowicą płodową wołową (FBS, Fetal Bvine Serum, Sigma-Aldrich) i antybiotykami (Sigma-Aldrich) w 5% atmosferze CO2 i odpowiedniej wilgotności (ryc. 1). Po tygodniu hodowli w warstwie, komórki przeniesiono na wchłanialną matrycę zbudowaną z włókien kwasu poliglikolowego (PGA firmy Cellon, Luxemburg). Komórki na matrycę nanoszono w trzech etapach co dziewięć godzin. Nanoszenie komórek w odstępach czasowych pozwoliło na przytwierdzenie się dużej liczby komórek do włókien matrycy. Każdorazowo wysiewano około 3,1 x 106 komórek na 0,025 cm3. Ostateczna średnia gęstość komórek 3T3 naniesionych na matrycę PGA wynosiła 107 komórek na 0,025 cm3. Matrycę PGA wraz z komórkami inkubowano przez trzy dni w po- żywce dla fibroblastów (DMEM + 10% FBS). Medium hodowlane zmieniano co sześć godzin, tak aby zapewnić warunki, jakie panują w bioreaktorach do przestrzennej hodowli komórek (ryc. 2).

Zwierzęta. Do eksperymentu wykorzystano 16 szczurów kapturowych (Rattus sp.). Sześciu szczurom w wieku sześciu miesięcy wykonano częściowe wycięcie pęcherza moczowego usuwając około 0,7 cm2 ściany przedniej i górnej. Cystostomię wytworzono z użyciem cewnika 4F, który wyprowadzono w okolicy bocznej brzucha. Ubytek ściany pęcherza zaopatrzono przygotowanym in vitro wszczepem o wymiarach około 0,8 x 0,5 cm. Płat zespolono ze ścianą pęcherza moczowego za pomocą dwóch pół- ciągłych szwów wchłanialnych z kwasu poliglikolowego 6- 0 (ryc. 3). Zwierzęta operowano w znieczuleniu ogólnym barbituranami. Obok grupy doświadczalnej były dwie grupy kontrolne. Pierwszą grupę kontrolną stanowiło pięć młodych szczurów, które poddano częściowej cystektomii, do drugiej grupy kontrolnej włączono pięć samców, których nie operowano.

Diagnostyka obrazowa. Po tygodniu uśpiono trzy szczury z grupy doświadczalnej poprzez przedawkowanie ketaminy i skoliny. Kolejnym trzem szczurom po dwóch tygodniach usunięto cystostomię, a następnie wykonano ultrasonografię przezpowłokową w celu oceny szczelności zespolenia po usunięciu cystostomii. Zwierzęta badano aparatem Medisson-SonoAce 5000 z użyciem sondy liniowej 8,5 MHz. Po miesiącu szczury z grupy doświadczalnej uśpiono po uprzednim wykonaniu cystografii. Wyniki badania kontrastowego pęcherza moczowego porównano z wynikami badań zwierząt z grup kontrolnych. Do badań kontrastowych użyto Uropoliny (Polpharma SA) rozcieńczonej roztworem soli fizjologicznej do 50%.

Ocena histologiczna i immunohistochemiczna. Preparaty pęcherza moczowego utrwalono w zbuforowanej formalinie. Z preparatów zatopionych w parafinie wykonano przekroje wybarwione hematoksyliną i eozyną. W celu oceny obecności naczyń krwionośnych wykonano barwienie z użyciem przeciwciał przeciwko czynnikowi von Willebrandta i przeciwko białkom CD31 i CD34. Wykonano dokumentację fotograficzną zarówno z etapu hodowli komórek, tworzenia płata, jak i zabiegów operacyjnych. Wyniki poddano analizie porównawczej.

Wyniki

Przebieg pooperacyjny był niepowikłany u wszystkich zwierząt. Wykonane badanie ultrasonograficzne wykonane po dwóch tygodniach od zabiegu nie wykazało obecności przestrzeni hypśchogenicznych w okolicy okołopęcherzowej, jak i jamie otrzewnej (ryc. 4). Objętość prawidłowego pęcherza moczowego mierzona za pomocą ultrasonografii przezpowłokowej wynosiła 0,5 +/-0,2 ml. Pojemność prawidłowego pęcherza moczowego szczura mierzona ilością środka kontrastowego użytego do cystografii wynosiła 0,8+/-0,2 ml. Pojemność pęcherzy poddanych plastyce wynosiła 0,7+/-0,2 ml. Nie udało się zmierzyć pojemności pęcherzy moczowych po częściowej cystektomii ze względu na mikcję występującą w trakcie podawania środka kontrastującego pęcherz moczowy (ryc. 5). Obserwowano niewielkie przenikanie kontrastu w obręb ściany pęcherza moczowego. OEwiadczyć to może o niecałkowitym przerośnięciu matrycy komórkami. Obserwacji tych nie potwierdzi ły badania mikroskopowe (ryc. 7).

Obraz makroskopowy ściany pęcherza moczowego po miesiącu od wykonania plastyki z użyciem wszczepu nie różnił się od ściany pęcherza prawidłowego (ryc. 6). Charakterystyczna była duża liczba zrostów między ścianą pęcherza moczowego poddanego plastyce a jelitami. Zrosty te łatwo odizolowano.

Badanie mikroskopowe wykazało obecność przerośniętego komórkami rusztowania PGA zespolonego z mięśniówką pęcherza moczowego. Włókna kwasu poliglikolowego uległy znacznej degradacji. W nielicznych miejscach obserwowano odczyn typu wokół ciała obcego. Obserwowane zmiany pozwoliły zidentyfikować wchłaniające się włókna kwasu poliglikolowego. Stwierdzono znacznego stopnia rozplem komórek 3T3, które tworzyły zbitą warstwę ściany pęcherza (ryc. 7). W obrębie wszczepu nie zidentyfikowano włókien mięśniowych. Analiza nie wykaza- ła również nacieków zapalnych w ścianie pęcherza moczowego.

W preparatach barwionych hematoksyliną i eozyną, jak i barwionych metodami immunohistochemicznymi z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko czynnikowi von Willebrandta i przeciwko antygenom CD31 i CD34, stwierdzono obecność naczyń krwionośnych w obrębie implantowanego płata (ryc. 8).

Na granicy zespolenia płata z warstwą ściany pęcherza moczowego obserwowano odczynowy przerost nabłonka pęcherza moczowego (ryc. 7). W środkowych częściach wszczepu obserwowano nabłonek jedno- i dwuwarstwowy bądź też zupełny jego brak.

Omówienie

Powiększenie pęcherza moczowego, mimo wielkiego postępu w technice zabiegów rekonstrukcyjnych z użyciem różnych odcinków przewodu pokarmowego, nadal jest wyzwaniem dla chirurgów [1]. Trwają przygotowania do wykonania w warunkach klinicznych powiększenia pęcherza moczowego przy użyciu ściany skonstruowanej in vitro z komórek autologicznych. Zastosowanie metod inżynierii tkankowej w urologii rekonstrukcyjnej przyniesie być mo- że rozwiązanie problemów związanych z rekonstrukcją dróg moczowych [7].

Powiększenie pęcherza moczowego z zastosowaniem wszczepu wytworzonego in vitro wymaga wyhodowania dużej liczby zróżnicowanych komórek [10]. Do celów rekonstrukcyjnych próbuje się również wykorzystać matryce zawierające komórki niezróżnicowane [8]. Pierwotne hodowle wymagają wielu czynników wzrostu dla komórek i dużego nakładu pracy i środków. Liczba komórek 107 przypadająca na jednego szczura użyta w doświadczeniu jest duża. W doświadczeniu zastosowano linię komórek transformowanych, których czas namnażania i koszty hodowli były niskie. Komórek tych jednak nie można przeszczepiać człowiekowi ze względu na obecność czynnika transformującego (wirus SV40), jak i ksenogeniczny charakter. W celu augmentacji ściany pęcherza moczowego człowieka konieczne byłoby wyhodowanie komórek autologicznych w liczbie 109-1010. Metoda ta - choć technicznie osiągalna - nie jest obecnie stosowana z przyczyn finansowych.

W pracy przedstawiono sposób wytworzenia in vitro płata do uzupełnienia ubytku pęcherza moczowego i reakcję organizmu zwierzęcego na obecność wyhodowanej tkanki.

Biomateriały jako nośniki dla komórek odgrywają kluczową rolę w inżynierii tkankowej, m.in. w rekonstrukcji układu moczowego. Zastosowanie odpowiednich biomateria łów pozwala komórkom na odpowiednie przytwierdzenie się, namnażanie i osiągnięcie prawidłowego różnicowania się dzięki wzmocnieniu sygnałów wywoływanych przez przyleganie komórek lub czynniki wzrostu. Biomateria ły stosowane w inżynierii tkankowej klasyfikuje się w trzech grupach: naturalne (np. kolagen lub alginian), bezkomórkowe matryce (np. podśluzówka pęcherza moczowego lub jelita cienkiego) i syntetyczne polimery (takie jak kwas poliglikolowy, kwas polimlekowy) [1,8]. Pozbawione komórek matryce naturalne służą jako materiały biologiczne do suplementacji moczowodu i cewki moczowej nawet wtedy, gdy stosowany materiał jest ksenogeniczny [9]. Do celów rekonstrukcji pęcherza moczowego z użyciem technik inżynierii tkankowej używane mogą być podłoża kolagenowe w połączeniu z komórkami autologicznymi [10]. W doświadczeniu zastosowano obojętny dla organizmu szczura polimer kwasu poliglikolowego, na który wysiano komórki ksenogeniczne linii 3T3 (fibroblasty mysie). Krótki okres degradacji biomateriału in vivo jest istotną jego właściwością. Zarówno produkty rozpadu matrycy, jak i pH towarzyszące rozpadowi wywierają wpływ na przeżycie komórek naniesionych na matrycę, bowiem liczba komórek przytwierdzonych do rusztowania ma decydujące znaczenie dla jego prawidłowego utrzymania w organizmie biorcy [11]. Zmiany pH medium w hodowli wynikały z ogromnej liczby komórek o dużym potencjale mitotycznym. Zmiany pH in vitro nie wynikały z rozpadu PGA, gdyż hydroliza PGA trwa kilka tygodni, a hodowla komórek na matrycy kilka dni [12]. Obraz mikroskopowy włókien kwasu poliglikolowego nie wskazywa ł na cechy ich rozpadu w czasie hodowli. Włókna PGA nadal miały dobre właściwości adhezyjne. PGA jest materia łem wykazującym dobre cechy matrycy i nośnika dla komórek w hodowli.

Czynnikiem zwiększającym przeżycie komórek i poprawiającym funkcję skonstruowanej in vitro tkanki jest waskulogeneza i angiogeneza. Obecność naczyń wwszczepionym grafcie jest decydującym czynnikiem dla jego późniejszego funkcjonowania. Celem poprawienia unaczynienia tkanek stosuje się czynniki wzrostu, takie jak VEGF lub bFGF [11].

W pracy nie stosowano czynników pobudzających tworzenie naczyń. Powstawanie naczyń w procesie waskulogenezy nie miało miejsca z powodu braku komórek macierzystych, które mogły być zaczątkiem naczyń. Badanie histopatologiczne przeszczepionego w ścianę pęcherza moczowego wszczepu wykazało obecność mikronaczyń krwionośnych i limfatycznych. Obserwowane naczynia krwionośne powstały w wyniku angiogenezy, której zaczątkiem były najprawdopodobniej naczynia sieci.

Nie zanotowano nacieków zapalnych w obrębie ściany pęcherza moczowego szczura w ciągu miesięcznej obserwacji. Fakt ten jest warty podkreślenia ze względu na to, iż stosowano komórki ksenogeniczne. Zjawisko to można wyjaśnić niewielkimi właściwościami immunogennymi komórek 3T3 myszy. Komórki te są w dużym stopniu odróż- nicowane. Czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w hodowli i indeks mitotyczny komórek 3T3 jest podobny do komórek nowotworowych. Jedyną oznaką obecności materiału ksenogenicznego w ścianie pęcherza moczowego szczura były obserwowane w preparatach mikroskopowych zrosty między pęcherzem a jelitami. Obecność zrostów może świadczyć również o przesiąkaniu moczu przez nową ścianę pęcherza w pierwszych dniach po zabiegu. Fakt ten potwierdziła obecność płynu w jamie otrzewnej u szczurów, które uśpiono po tygodniu od przeprowadzenia zabiegu operacyjnego.

Miesięczna obserwacja nie pozwoliła stwierdzić obecności nabłonka pęcherza moczowego na całej powierzchni wszczepionego wszczepu. Całkowite pokrycie powierzchni wszczepu wymagałoby, jak wykazują inne prace, obserwacji 3- 6-miesięcznych [1].

Wnioski

Otrzymane w warunkach doświadczalnych wyniki wskazują na możliwość zastosowania wytworzonych metodą inżynierii tkankowej wszczepów do rekonstrukcji dróg moczowych. Zastosowanie tej metody w warunkach klinicznych wymagać będzie przygotowania dużej liczby komórek koniecznych do wytworzenia wszczepu odpowiednich rozmiarów.

piśmiennictwo

  1. Wolski Z: Poszerzenie moczowodu izolowaną pętlą jelita cienkiego pozbawioną błony śluzowej. Badania doświadczalne i spostrzeżenia kliniczne. Praca Habilitacyjna. Akademia Medyczna w Warszawie, Warszawa 1994.
  2. Hafez AT, McLorie G, Gilday D, Laudenberg B, Upadhyay J, Bagli D, Khoury AE: Long-term evaluation of metabolic profile and bone mineral density after ileocystoplasty in children. J Urol 2003; 170: 1639-1641.
  3. DeFoor W, Tackett L, Minevich E, Wacksman J, Sheldon C: Risk factors for spontaneous bladder perforation after augmentation cystoplasty. Urology 2003; 62: 737-741.
  4. Abes M, Sarihan H, Madenci E: Evaluation of bone mineral density with dual x-ray absorptiometry for osteoporosis in children with bladder augmentation. J Pediatr Surg 2003; 38: 230-232.
  5. Gough DC. Enterocystoplasty. BJU Int. 2001; 88: 739-743.
  6. Borówka A: Filling of extensive defects of the bladder with collagen membrane. Pol Tyg Lek 1981; 36: 1525-1527.
  7. Atala A: New methods of bladder augmentation. BJU Int 2000; 85 Suppl 3: 24-34; discussion: 36.
  8. Kim BS, Baez CE, Atala A: Biomaterials for tissue engineering. World J Urol 2000; 1: 2-9.
  9. Sievert KD, Tanagho EA: Organ-specific acellular matrix for reconstruction of the urinary tract. World J Urol 2000; 1 (18): 19-25.
  10. Falke G, Caffaratti J, Atala A: Tissue engineering of the bladder. World J Urol 2000; 1 (18): 36-43.
  11. Soker S, Machado M, Atala A: Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering. World J Urol 2000; 1 (18): 10-18.

adres autorów

Tomasz Drewa
ul. Karłowicza 24
85-092 Bydgoszcz
tel. (0 52) 585 37 37, fax (0 52) 585 37 42