WPŁYW CZYNNIKA WZROSTU NASKÓRKA NA ODNOWĘ BŁONY ŚLUZOWEJ MOCZOWODU
Artykuł opublikowany w Urologii Polskiej 1986/39/3.

Czynnik wzrostu naskórka (epidermal growth factor ? EGF) jest to 53-aminokwasowy peptyd wyizolowany z ślinianek podżuchwowych przez Cohena w 1972 roku (4). Drugi peptyd, urogastron, wyizolowany przez Gregorego w 1975 roku (10) z ludzkiego moczu, posiada także 53 aminokwasy, z których 37 są wspólne dla obu peptydów. W późniejszych badaniach ustalono, że oba peptydy mają ten sam zakres biologicznego działania na izolowanych komórkach (11) oraz podobny wpływ na wy­dzielanie soku żołądkowego. Ponieważ jest znacznie łatwiej wyizolować zwierzęcy EGF niż urogastron, z tej przyczyny w większości znanych badań EGF jest stosowany.

EGF pobudza wzrost komórek w różnych narządach (5), zwiększając w nich aktywność dekarboksylazy ornityny, enzymu niezbędnego w syn­tezie poliamin, które są ściśle powiązane z wzrostem tkanki.

Jest interesującym, że ludzki urogastron i zwierzęcy EGF dzielą wspólny receptor w ludzkich fibroblastach (11). Badania immunofluore-scencyjne wykazały obecność urogastronu, znalezionego uprzednio w mo­czu, także w śliniankach i ślinie (8). Jego stężenie w surowicy krwi jest kilkakrotnie niższe niż w ślinie przy równoczesnym niezwykle wy­sokim poziomie urogastronu (7), czy EGF (13) wydzielanego z moczem. Ilości te były ponad tysiąc razy wyższe niż ich ilość obserwowana w su­rowicy krwi i ponad 100 razy większe niż ilość mierzona w gruczołach ślinowych, gdzie hormon ten jest głównie produkowany i uwalniany.

Uzyskane wyniki w wcześniejszych badaniach sugerują uwalnianie EGF do krążenia i do światła przewodu pokarmowego, gdzie wpływa na przyspieszenie odnowy śluzówki (6). Rola EGF w nerce pozostaje do tej chwili niewyjaśniona. Wydało się więc celowym określenie wpływu endogennego i egzogennego EGF na wzrost i odnowę śluzówki moczo­wodu.

Nr 3 Wzrost naskórka a odnowa błony śluzowej moczowodu 219

MATERIAŁ I METODYKA

Do badań użyto szczury gatunku Wistar o ciężarze 190?200 g. Na 24 godziny przed operacją szczury głodzono i następnie w narkozie ete­rowej usunięto ślinianki podżuchwowe i przyuszne u dwudziestu szczu­rów. U dziesięciu szczurów (grupa kontrolna) wykonano nacięcie na skórze szyi, które zaopatrzono pojedynczymi szwami. Trzy tygodnie po operacji szczury podzielono na trzy grupy. Pierwszą grupę stanowiły zwierzęta kontrolne, u których nacięto i zeszyto skórę. Grupie tej po­dawano podskórnie sól fizjologiczną. Druga grupa, to dziesięć szczurów bez ślinianek, które otrzymywały 3 razy dziennie podskórnie sól fizjolo­giczną. W trzeciej grupie użyto dziesięć szczurów bez ślinianek, które otrzymywały podskórnie 3 razy dziennie EGF (Collaborative Research Inc. USA). Podskórnie podawano sól fizjologiczną lub EGF przez 10 dni. Sól fizjologiczną i EGF rozpuszczano w 0,3 ml 16,0°/o żelatyny. W 6 go­dzin po ostatnim zastrzyku zwierzęta ważono, usypiano eterem i po otwarciu jamy brzusznej pobierano krew z aorty, którą odwirowywano. Równocześnie pobierano z pęcherza mocz. Surowicę i mocz zamrażano do temperatury ?20°C celem późniejszego oznaczenia poziomu hormonu metodą radioreceptorową. Moczowody Wypreparowano w całości i po wycięciu oczyszczono z otaczających tkanek, a następnie homogenizowano w obecności 0,2 N kwasu nadchlorowego. Hydrolizę RNA z komórek przeprowadzono w 0,3 N KOH w temperaturze 37°C. DNA i białko pre-cypitowano przy pomocy kwasu nadchlorowego. Po 10-ciu minutach pre­cypitacji wirowano tkankę i oznaczano stężenie RNA w supernatancie metodą Cerriottiego (3). DNA rozpuszczono w 10,0% kwasie nadchloro­wym, gotując przez 20 minut zawartość probówek. Zdenaturowane białko oddzielono poprzez wirowanie. DNA oznaczono metodą opisaną przez Burtona (1) w modyfikacji Gilesa i Myersa (9). Ilość RNA i DNA wy­rażono w miligramach na całkowitą masę narządu.

EGF oznaczono metodą radioreceptorową według metodyki opisanej przez Imai, Tsushima, Sazaki i Matsuzaki (12) z zastosowaniem wątroby myszy jako źródła receptora. Czułość metody pozwalała na wykrycie 10 pg/ml EGF. 125J ? EGF otrzymano z Collaborative Research Inc. 150 u?i/|xg.

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej używając testu ,,t" Studenta i wyrażono jako średnie ? SEM.

WYNIKI

W warunkach kontrolnych poziom EGF w surowicy krwi wynosił 46 ? 13 pg/ml (ryc. 1). Usunięcie ślinianek powodowało statystycznie znamienny spadek poziomu hormonu do wartości 13 ? 7 pg/ml. U szczu­rów bez ślinianek, którym podano 3 razy dziennie przez 10 dni EGF poziom jego, mierzony 6 godzin po ostatnim zastrzyku był statystycznie znamiennie wyższy niż kontrolny i wynosił 164 ? 42 pg/ml.

Poziom EGF mierzony w moczu u tych samych zwierząt wykazał równoległy do poziomu w surowicy krwi spadek ilości hormonu po usu­nięciu ślinianek (ryc. 2). Z wartości kontrolnej 310 ? 52 ng/ml obniżył się u szczurów bez ślinianek do poziomu 112 ? 13 ng/ml. Podanie egzo­gennego hormonu powodowało jego wzmożone wydzielanie w moczu (568 ? 40 ng/ml). Zwraca uwagę fakt, że jego stężenie jest około tysiąc razy większe w moczu niż w surowicy krwi.

Usunięcie ślinianek obniżyło ciężar moczowodów o około 23,0 % (ryc. 3). Podanie EGF trzy razy dziennie przez 10 dni powodowało u szczurów bez ślinianek wzrost ciężaru moczowodu w stosunku do ciężaru moczowodu kontrolnego o 34,0 %.

Ponieważ nie istniały znamiennie statystyczne różnice w ciężarze, a także w zawartości RNA czy DNA pomiędzy lewym i prawym moczo­wodem u pojedynczego szczura we wszystkich badanych grupach do­świadczenia przeprowadzono i wyniki wyliczono bez podziału na lewy i prawy moczowód.

Pokazane w tabeli I ilości RNA i DNA wyrażają całkowitą zawartość kwasów w moczowodzie gdyż zmierzone w doświadczeniach stężenie sub­stancji wyrażono w przeliczeniu na całkowity ciężar moczowodu.

Usunięcie ślinianek powodowało statystycznie znamienny spadek ilości RNA i DNA. Ich wzajemny stosunek w grupie kontrolnej i w grupie zwierząt bez ślinianek nie uległ zmianie EGF podany 3 razy dziennie przez dziesięć dni w dawce 10 ?g/kg powodował odwrócenie zmian wy­wołanych brakiem EGF ze ślinianek, co więcej ilości RNA i DNA były znamiennie statystycznie wyższe niż w grupie kontrolnej. Stosunek RNA/DNA uległ nieznacznemu wzrostowi, co świadczy o nieco większym przyroście w komórce ilości RNA w stosunku do DNA. Powyższe zmiany są w ścisłej korelacji z spadkiem lub wzrostami ciężaru moczowodów, a także z zawartością EGF w surowicy krwi i w moczu. U żadnego ze zwierząt nie obserwowano spadku ciężaru ciała po operacji i zabu­rzeń w przyjmowaniu pokarmu. Nie obserwowano też zmian krwotocz­nych w moczowodach, nerkach i otaczających tkankach.

DYSKUSJA

EGF i urogastron należą do peptydów, których obecność opisywano w śliniankach, ślinie, a także w gruczołach Brunnera w dwunastnicy (1, 8). Usunięcie ślinianek powodowało znaczne obniżenie stężenia hor­monu w surowicy, jednakże nie całkowite. Przyczyną powyższego zja­wiska było pozostawienie pojedynczych gruczołów ślinowych, a także to, że nie usuwaliśmy dwunastnicy, w której gruczoły Brunnera są znanym źródłem hormonu. Okazało się jednak, że samo usunięcie ślinianek przy-usznych i podżuchwowych wywołało zmiany atroficzne w moczowodach.

Przyjmuje się, że gdy zachodzą zmiany ilości RNA i DNA propor­cjonalne tak, że wyliczony ich wzajemny stosunek nie ulega zmianie, to mówimy o wzroście lub zaniku narządu zależnie od wzrostu lub spadku badanych wartości. Gdy stosunek RNA/DNA zmienia się zna­miennie statystycznie mówimy o przeroście lub zmniejszeniu masy ko­mórki. Ponieważ w naszych doświadczeniach stosunek ten uległ zmianie możemy powiedzieć, że przy obniżeniu poziomu EGF błona śluzowa moczowodu uległa częściowemu zanikowi.

Fizjologiczna rola EGF i jego odpowiednika u człowieka urogastronu nie jest jeszcze poznana. Bardzo silna korelacja pomiędzy ilością wyda-laneeo EGF z moczem i ilością wydalanej kreatyniny (14) sugeruje, że EGF jest jedynie przez nerki filtrowany, a nie dodatkowo wydzielany. Stosunek wydalonego EGF do klirensu kreatyniny jest mniejszy od 1 co świadczy, że wydala się także inną drogą. Jak wiadomo wydalany jest ze śliną i wykazano jego pobudzający wpływ na wzrost śluzówki przewodu pokarmowego (6).

Zastanawiający jest niezwykle wysoki poziom wydalonego hormonu w moczu w stosunku do poziomu obserwowanego w surowicy krwi. Wyjaśnianie tego faktu wymaga dalszych badań. Poziomy hormonu uzy­skane przez nas są w ścisłej korelacji z wynikami uzyskanymi przez innych autorów metodą radioimmunologiczną (13). To wysokie stężenie aktywnego hormonu w moczu wskazuje na jego rolę fizjologiczną w od­nowie śluzówki. Szczególnie wymownym jest fakt, że obniżenie endo­gennego poziomu hormonu wywołuje zmiany atroficzne. Przywrócenie prawidłowego wzrostu śluzówki przy podaniu EGF z zewnątrz wykazuje, że brak jego jest właśnie odpowiedzialny za zaistniałe zmiany. Dysku­syjną jedynie może być zastosowana dawka peptydu (10 fig/kg), którą można by uznać za dawkę farmakologiczną. Przemawiają przeciwko temu jednak dwa fakty. Po pierwsze uzyskany w surowicy krwi i w moczu poziom EGF po jego egzogennym podaniu przewyższał poziom endogen­nego hormonu jedynie o kilkadziesiąt procent i mieścił się w tym sa­mym przedziale ilościowym. Po drugie zastosowana dawka jest uznana za fizjologiczną w hamowaniu wydzielania żołądkowego (10). Uzyskany z moczu urogastron utrzymuje swoją aktywność biologiczną i jest za­leżny od innych hormonów w szczególności androgenów (2). Nasze obser­wacje wskazują na udział EGF w odnowie śluzówki dróg moczowych a także, że jest to jego działanie fizjologiczne.

WNIOSKI

1.Obniżenie poziomu EGF powoduje spadek ciężaru moczowodów i zmniejszenie w nich ilości RNA i DNA, co wskazuje na ich atrofię.

2.Powyższe zmiany są wywołane obniżeniem endogennego poziomu hormonu, dlatego możemy przyjąć, że wpływ na śluzówkę moczowodu jest jego funkcją fizjologiczną.

3.Nerki wydalają EGF w stężeniu wielokrotnie wyższym niż jego poziom w surowicy krwi. Fakt ten pozostaje nadal niewyjaśniony.

1. 1. Burton H.: A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine
2. reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleotic acid. Biochem. J.,
3. 1956, 62, 315. ? 2. Bynny R. L., Orth D. N.: Epidermal growth factor: effects
4. of androgens and adrenic agents. Endocrinology, 1974, 95, 776. ? 3. Ceriotti G.:
5. Determination of nucleic acids in animals tissues. J. Biol. Chem., 1955, 214, 59. ?
6. 4. Cohen S.: Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor
7. eruption and eyelid opening in the new-born animal. J. biol. Chem., 1972, 237,
8. 1155. ? 5. Cohen S., Savage C. R.: Recent studies on the chemistry and biology
9. of epidermal growth factor. Recent Prog. Horm. Res., 1974, 30, 531. ? 6. Dembiń­
10. ski A., Gregory H., Konturek S. J., Polański M.: Trophic action of epidermal
11. growth factor on the pancreas and gastroduodenal mucosa in rat. J. Physiol. Lond.,
12. 1982, 325, 35, ? 7. Doiley G. E., Kraus J W., Orth D. N.: Homologus radioimmuno-
13. assay for human epidermal growth factor (urogastrone). J. clin. Endocr. Metab.,
14. 1978, 46, 929. ? 8. Elder J. B., Williams G., Lacey E., Gregory H.: Cellular loca-
15. lization of human urogastrone epidermal growth factor. Nature, Lond., 1978, 271,
16. 466. ? 9. Giles K. W., Myers A,: An improved diphenylamine method for the
17. estimation of deoxyribonucleic acid. Nature, Lond., 1975, 206, 93. ? 10. Gregory H.:
18. Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth
19. factor. Nature, Lond., 1975, 257, 325.
20. 11. Hollenberg M. D., Gregory H.: Human urogastrone and mouse epidermal
21. growth factor ahare a common receptor. Life Sci., 1976, 20, 267. ? 12. Imai Y.,
22. Tsuhima T., Sazaki N., Matsuzaki F.: Radioreceptor assay for epidermal growth
23. factor, growth and growth factors. Shizuka K. and Takano K. University Park
24. Press. 1979. ? 13. Olsen S. P., Nexo E.: Quantitation of epidermal growth factor
25. in the rat. Identification and partial characterization of duodenal EGF. Scand. J.
26. Gastroent., 1983, 18, 771. ? 14. Starkey R. H., Orth D. N.: Radioimmunoassay of
27. human epidermal growth factor (urogastrone). J. clin. Endocr. Metab., 1978, 46, 929.