english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Wprowadzenie

Rak pęcherza moczowego jest czwartym co do częstości występowania na świecie nowotworem złośliwym u mężczyzn, a ósmym u kobiet. Rocznie w Europie rozpoznaje się średnio 120 000 nowych przypadków zachorowania na ten typ nowotworu i odpowiednio 55 tysięcy w USA [1]. W Polsce stanowi on u mężczyzn 6,1% wszystkich nowotworów złośliwych, a u kobiet 1,6% [2]. Rak wywodzący się z nabłonka przejściowego (TCC - transitional cell carcinoma) stanowi powyżej 90% nowotworów pęcherza moczowego. Na podstawie głębokości naciekania ściany pęcherza moczowego można wyróżnić guzy powierzchowne (70%) oraz naciekające (30%) [3]. Wzrastająca zachorowalność i brak w pełni skutecznych metod leczenia chorych na raka pęcherza moczowego stanowią istotny problem onkologiczny. Współczesne badania koncentrują się na poszukiwaniu nowych i doskonaleniu aktualnie stosowanych sposobów terapii przeciwnowotworowej.

Ligand czynnika martwicy nowotworu indukujący apoptozę (TRAIL - Tumor Necrosis Factor - Related Apoptosis - Inducing Ligand) jest białkiem błonowym typu II, należącym do rodziny TNF (Tumor Necrosis Factor). TRAIL ma zdolność indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych, nie będąc cytotoksycznym w stosunku do prawidłowych komórek organizmu. To wskazuje na rolę TRAIL jako cząsteczki efektorowej w zabijaniu komórek raka oraz na jego potencjalne zastosowanie w terapii przeciwnowotworowej [4,5,6].

Cząsteczka TRAIL występuje w postaci rozpuszczalnej (sTRAIL) lub jest związana z powierzchnią komórek immunokompetentnych, takich jak makrofagi, limfocyty lub neutrofile [4,6]. Ligand działa poprzez receptory śmierci TRAIL-R1 (DR4) i TRAIL-R2 (DR5, KILLER) na powierzchni komórek docelowych. TRAIL indukuje apoptozę w komórkach nowotworowych po przyłączeniu się do wyżej wymienionych receptorów śmierci [7].

W badaniach in vitro wykazano zróżnicowaną podatność komórek nowotworowych na apoptozę mediowaną TRAIL. Wstępne obserwacje dowiodły, że TRAIL ma zdolność selektywnej indukcji apoptozy w komórkach ponad 60% badanych linii komórek transformowanych [5,6]. Wrażliwość komórek nowotworowych na cytotoksyczne działanie TRAIL wynika między innymi z różnic w dystrybucji receptorów TRAIL na powierzchni tych komórek, jak również z obecności wewnątrzkomórkowych białek inhibitorów transdukcji sygnału prowadzącego do apoptozy [8].

Wywołanie apoptozy w komórkach nowotworowych indukowanej przez TRAIL jest często warunkowane współdziałaniem czynników fizycznych (np. promieniowania jonizującego) lub czynników chemicznych (np. cytostatyków i cytokin) [9].

Wstępne badania nad apoptozą komórek niektórych linii nowotworowych, poddanych skojarzonemu działaniu cytostatyków oraz rekombinowanego TRAIL, wskazują na skuteczność tej terapii [10]. W doświadczeniach zastosowano kombinację TRAIL z cytostatykiem w stosunku do komórek raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego.

Cel pracy

Celem podjętych badań jest ocena potencjalizacji cytotoksycznego działania TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego przez cytostatyki. Doświadczenia prowadzono na komórkach TCC linii SW780 o stopniu zróżnicowania histopatologicznego G1, który to stopień dominuje wśród raków powierzchownych pęcherza moczowego. Badane komórki poddano działaniu TRAIL i/lub cytostatyków. Użyte w eksperymencie cytostatyki: doksorubicyna, epirubicyna, gemcytabina i mitomycyna C są stosowane w terapii adjuwantowej w postaci wlewek dopęcherzowych u chorych z powierzchownymi guzami pęcherza moczowego [11].

Materiał i metoda

Komórki raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego linii SW780

W badaniach użyto komórki linii SW780, zakupione w American Type Culture Collection - ATCC (Manassas, VA, USA), nr kat. CRL-1739. Komórki wywodzą się z nabłonka przejściowego (carcinoma urotheliale) o stopniu zróżnicowania G1, wyizolowane przez Leibovitza w 1974 r. z guza pęcherza moczowego 80-letniej kobiety rasy kaukaskiej [12]. Hodowlę komórkową prowadzono w plastikowych butelkach o pojemności 70 i 500 ml (Nunc A/S Roskilde, Dania). Jako medium hodowlane stosowano podłoże Leibovitz´s L-15 z dodatkiem L-glutaminy (2mM) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) penicyliny (100 IU/ml), streptomycyny (100 mg/ml) oraz 10% płodowej surowicy cielęcej (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA), inaktywowanej termicznie. Komórki hodowano w sposób ciągły w temperaturze 37oC, w atmosferze powietrza, w inkubatorze przy 100% wilgotności względnej. Pasaże wykonywano trzy razy w tygodniu.

Zaadherowane komórki odrywano od dna naczynia, stosując roztwór trypsyny i wykonywano z nich zawiesiny, które przeznaczano do eksperymentów. Liczba badanych komórek w każdym eksperymencie wynosiła 106 w 1 ml podłoża.

Cytostatyki

Badaniami objęto cztery cytostatyki: doksorubicynę (Ebewe Arzneimittel GmbH, Uterach, Austria), epirubicynę (Pharmacia, Milano, Włochy), gemcytabinę (Eli Lilly, Fegersheim, Francja) oraz mitomycynę C (Kyowa Hakko, Berkshire, Wielka Brytania).

TRAIL

W badaniach zastosowano rozpuszczalny, ludzki, rekombinowany "TRAIL" [rhsTRAIL (CC-mutant)], otrzymany z E. coli, rhsTRAIL rozpuszczano w buforze "TRAIL Storage and Dilution Buffer". Produkty zakupiono w firmie Alexis (San Diego, CA, USA).

Ocena cytotoksyczności

a. Pomiar aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej (test MTT)

Cytotoksyczne działanie badanych czynników na komórki raka pęcherza moczowego oznaczano testem MTT (bromo-3-[4,5-dimetylotiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium), polegającym na pomiarze aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej [13]. Reagenty zakupiono w firmie Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA).

b. Pomiar aktywności dehydrogenazy mleczanowej (test LDH)

Cytotoksyczne działanie badanych czynników na komórki raka pęcherza moczowego SW780 oceniano poprzez pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH) [14] testem firmy Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Niemcy). Dehydrogenaza mleczanowa uwalniana jest z cytoplazmy do medium hodowlanego w wyniku uszkodzenia błony komórkowej i lizy komórek. Wzrost aktywności LDH w supernatantach hodowli komórkowych koreluje z odsetkiem martwych komórek.

Wyniki

Cytotoksyczne działanie TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego linii SW780

Efekt cytotoksycznego działania TRAIL na komórki SW780 był wprost proporcjonalny do stężenia użytego ligandu: dla stężenia 5 ng/ml wynosił 22% +/-0,7%, 10 ng/ml - 28,1% +/-2,9%, 50 ng/ml - 53% +/-2%, 100 ng/ml - 54,2% +/-1,8% zabitych komórek nowotworowych. Wyniki cytotoksycznego działania TRAIL oznaczone w teście MTT przedstawiano na ryc. 1.

Zastosowanie wyższego niż 50 ng/ml stężenia ligandu równego 100 ng/ml nie wpłynęło znamiennie na wzrost jego cytotoksyczności w stosunku do komórek SW780. W badanych stężeniach, wynoszących od 5 do 100 ng/ml TRAIL nie wywoływał lizy komórek raka pęcherza moczowego określanej w teście LDH. W dalszych etapach eksperymentu zastosowano TRAIL w stężeniu 5 ng/ml, 10 ng/ml i 50 ng/ml.

Cytotoksyczne działanie cytostatyków na komórki raka pęcherza moczowego linii SW780

Zastosowano cztery cytostatyki: doksorubicynę gemcytabinę, epirubicynę, mitomycynę C. Stężenie końcowe badanego związku wynosiło 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml i 20 mg/ml. Wyniki cytotoksycznego działania badanych cytostatyków na komórki SW780 mierzonego w teście MTT przedstawiono na ryc. 2-5.

Efekt cytotoksyczny w stosunku do komórek raka pęcherza moczowego SW780 po zastosowaniu cytostatyków zależał od rodzaju i stężenia badanego leku. W najmniejszym stężeniu 1 mg/ml badane związki wykazywały podobną cytotoksyczność równą 19,2% +/-0,7% zabitych komórek dla mitomycyny C, 18,6% +/-1,2% dla gemcytabiny, 15,4% +/-2,1% dla doksorubicyny. Jedynie epirubicyna w tym stężeniu wywoływała nieco słabszy efekt cytotoksyczny w stosunku do komórek SW780 (3,5% +/-3,4%). Natomiast w najwyższym stosowanym stężeniu równym 20 mg/ml epirubicyna charakteryzowała się największą cytotoksycznością równą 59,4% +/-1,5% zabitych komórek nowotworowych. Pozostałe cytostatyki wykazywały nieco niższy, podobny efekt cytotoksyczny: doksorubicyna - 49,4% +/-1,7%, mitomycyna C - 47,2% +/-1,2% i gemcytabina - 31,8% +/-0,8% zabitych komórek nowotworowych.

W badanych stężeniach cytostatyki nie wywoływały lizy komórek raka pęcherza moczowego oznaczanej w teście LDH.

Cytotoksyczne działanie TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego linii SW780 po zastosowaniu cytostatyków

Zastosowane cytostatyki nasilały cytotoksyczny efekt działania TRAIL w stosunku do komórek SW780. Wyniki przedstawiające cytotoksyczność obu badanych czynników (dany cytostatyk w skojarzeniu z ligandem TRAIL) uzyskane w teście MTT przedstawiano na ryc. 6-9.

Zaobserwowano zwiększenie cytotoksycznego działania ligandu na komórki SW780 po zastosowaniu każdego z badanych cytostatyków. Maksymalny efekt cytotoksyczny osiągnięto dla najwyższych stężeń obu czynników i wynosił on: 70,9% +/-0,6% dla mitomycyny C, 71,7% +/-0,9% dla gemcytabiny, 82,6% +/-1,2% dla epirubicyny oraz 85,9% +/-1% zabitych komórek dla doksorubicyny. Wzrost cytotoksycznego efektu w stosunku do komórek SW780 odnotowano również dla niższych stężeń TRAIL i cytostatyków. Dla komórek tych cytotoksyczność po użyciu wyłącznie samego ligandu w stężeniu 5-10 ng/ml wynosiła od 22% +/-0,7%, 10 ng/ml do 28,1% +/-2,9%. Zastosowanie cytostatyku w stężeniu 5-10 mg/ml zwiększyło procent zabitych komórek raka do 34,5% +/-1,5% - 54,6% +/-1,3% dla mitomycyny C, do 47,5% +/-1,2% - 52,8% +/-2,2% dla gemcytabiny, do 54,9% +/-1,7% - 67,5% +/-1,2% dla epirubicyny oraz do 54,1% +/-1,8% - 75,1+/-0,6% dla doksorubicyny. W najniższym stężeniu cytostatyku równym 1 mg/ml najsilniejsze działanie wspomagające TRAIL wykazywała doksorubicyna (51,8% +/-0,7% dla ligandu w stężeniu 5 ng/ml, 55,7% +/-1,5% dla stężenia ligandu 10 ng/ml i 60% +/-0,9% dla stężenia ligandu 50 ng/ml). W przypadku zastosowania doksorubicyny zarówno w najniższym, jak i najwyższym stężeniu odnotowano największą potencjalizację cytotoksycznego działania TRAIL, średnio o 30-50% w stosunku do działania samego ligandu.

W badanych stężeniach cytostatyki w kombinacji z TRAIL nie wywoływały lizy komórek raka pęcherza moczowego oznaczanej poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy mleczanowej.

Dyskusja

Użyty w eksperymencie model komórkowy SW780 odpowiada stopniu zróżnicowania histopatologicznego G1. Komórki TCC o takim stopniu złośliwości stanowią największy odsetek wśród guzów powierzchownych pęcherza moczowego [11]. Głównym celem leczenia tego typu nowotworów jest zapobieganie ich nawrotom i progresji [15,16]. W licznych badaniach potwierdzono, że stosowanie dopęcherzowych wlewek cytostatyków może zmniejszyć ryzyko wznowy guza TCC o około 50%, nie ma natomiast wpływu na progresję nowotworu. Krótki okres remisji lub brak trwałego efektu, a także nieakceptowane przez chorego działania niepożądane są przyczyną przerwania chemioterapii dopęcherzowej [3,16,17].

Intensywne badania nad zastosowaniem naturalnych czynników o dużej aktywności przeciwnowotworowej i braku toksycznych efektów w stosunku do prawidłowych komórek wskazują na nowy kierunek w leczeniu pacjentów z guzami pęcherza moczowego.

Obecność TRAIL na powierzchni komórek immunokompetentnych i jego rola w nadzorze immunologicznym skłoniły niektórych badaczy do zastosowania tego ligandu w skojarzeniu z chemio-, radio- lub immunoterapią [9]. Zaobserwowano, że rozpuszczalny TRAIL ma zdolność selektywnej indukcji apoptozy w komórkach ponad 60% badanych linii komórek nowotworowych [4,6]. Takie spostrzeżenia przemawiają za szerokim spektrum przeciwnowotworowego działania TRAIL w badaniach in vitro jak i in vivo [5,6]. Zastosowanie TRAIL w skojarzeniu z cytostatykami, promieniowaniem jonizującym lub cytokinami pozwoliłoby z jednej strony zwiększyć skuteczność terapii przeciwnowotworowej, a z drugiej strony zredukować dawki stosowanych terapeutyków i obniżyć ogólnoustrojową toksyczność, przy zachowanej takiej samej aktywności przeciwnowotworowej [9].

Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że wszystkie zastosowane cytostatyki nasilały cytotoksyczne działanie TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego SW780, jednak w przypadku doksorubicyny uzyskano największą potencjalizację cytotoksycznego działania ligandu. Obserwacje te pokrywają się z wynikami uzyskanymi przez innych autorów. Zespoły naukowców z Uniwersytetu Południowej Karoliny oraz z Uniwersytetu w Szanghaju w badaniach in vitro i in vivo komórek raka prostaty dowiódł, że doksorubicyna przełamywała oporność tych komórek na TRAIL poprzez obniżenie ekspresji antyapoptotycznego białka cFLIP (cFLIP - cellular Fas associated death domain - Like interleukin-1beta-converting enzyme - Inhibitory Protein) [18,19,20]. Inni autorzy, badając komórki raka prostaty i raka nerki potwierdzili synergistyczne działanie doksorubicyny z TRAIL, wyrażające się wzrostem cytotoksyczności średnio od 30% do 40% w stosunku do działania samego ligandu. Efekt tej skojarzonej terapii tłumaczą wzrostem ekspresji receptorów TRAIL-R1 i TRAIL-R2 lub aktywacją kaskady kaspaz (wzrostem aktywności kaspazy 3, 8 i 9) [21,22].

Podobnie jak doksorubicyna, równie silnym efektem wspomagającym działanie TRAIL na komórki SW780 charakteryzowała się epirubicyna. Obserwację tę w odniesieniu do komórek raka nerki podzielają również Wu, Ogawa i Kakehi [23].

Wzrost cytotoksycznego działania TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego odnotowano również po dodaniu gemcytabiny. Potwierdzili to Zisman w stosunku do komórek raka prostaty oraz Xu i Hylander w stosunku do komórek raka trzustki. We wszystkich tych doświadczeniach zaobserwowano synergistyczny efekt działania gemcytabiny i TRAIL [24,25,26]. Niezbędne są jednak dalsze badania, wyjaśniające mechanizm uwrażliwienia komórek nowotworowych z udziałem tego cytostatyku.

Niewiele dotąd wiadomo również na temat działania mitomycyny C w skojarzeniu z TRAIL. Potwierdzono wzrost aktywacji kaspazy 8 i 3 oraz wzrost ekspresji proapotycznego białka Bax w komórkach raka okrężnicy po zastosowaniu mitomycyny C w kombinacji z TRAIL [27]. Mizutani, badając działanie szeregu cytostatyków w skojarzeniu z TRAIL na komórki raka pęcherza moczowego linii T24, nie zaobserwował wzrostu liczby komórek apoptotycznych po zastosowaniu mitomycyny C w stosunku do działania samego ligandu. Potwierdził natomiast zwiększenie cytotoksycznego działania TRAIL na komórki T24 po zastosowaniu cisplatyny [28].

Obserwacje poczynione przez innych autorów potwierdzają, że cytostatyki mogą nasilać efekt działania TRAIL w stosunku do komórek nowotworowych. Wyniki uzyskane w doświadczeniach na komórkach raka pęcherza moczowego SW780 są obiecujące i zachęcają do dalszych eksperymentów. W oparciu o zastosowane w doświadczeniach testy cytotoksyczności wykazano brak lizy komórek raka pęcherza moczowego po zastosowaniu badanych czynników (cytostatyków i/lub TRAIL). Pozwala to zatem przypuszczać, że użycie tych związków indukuje śmierć komórki nowotworowej na drodze apoptozy, a nie nekrozy. Ostateczne potwierdzenie tego faktu, a także określenie strategii przełamywania oporności komórek raka pęcherza na działanie TRAIL z udziałem cytostatyków, wymaga kontynuacji badań uwzględniających molekularne aspekty apoptozy indukowanej przez TRAIL.

Wnioski

Cytotoksyczny efekt działania TRAIL na komórki SW780 był wprost proporcjonalny do użytego stężenia ligandu i wynosił od 22% +/-0,7% do 53% +/-2%.

Badane komórki raka pęcherza moczowego wykazywały zróżnicowaną wrażliwość na działanie cytostatyków, zależną od stężenia i rodzaju użytego związku.

Zaobserwowano zwiększenie cytotoksycznego działania TRAIL na komórki raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego po zastosowaniu badanych cytostatyków.

1. Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA: Cancer Statistics. CA Cancer J Clin 1999, 49, 8-31.
2. Didkowska J, Wojciechowska U, Tarnowski W, Zatoński W: Nowotwory złośliwe w Polsce w 1999. Centrum Onkologii - Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie. Zakład Epidemiologii i Prewencji Nowotworów. Warszawa, 2002, 15-37.
3. Oesterlinck W, Lobel B, Jakse G: Guidelines on bladder cancer. Eur Urol 2004, 41, 105-112.
4. Ashkenazi A, Pai R, Fong S et al: Safety and antitumor activity of recombinant Apo2 ligand. J Clin Invest 1999, 104, 155-162.
5. Kelley SK, Harris LA, Xie D et al: Pre-clinical studies to predict the disposition of Apo2L. tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in humans: characterization of in vivo efficacy, pharmacokinetics, and safety. J. Pharmacol Exp Ther 2001, 299, 31-38.
6. Almasan A, Ashkenazi A: Apo2L. TRAIL: apoptosis signaling, biology and potential for cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev 2003, 14, 337-348.
7. Yagita H, Takeda K, Hayakawa Y: TRAIL and its receptors as targets for cancer therapy. Cancer Sci 2004, 95, 777-783.
8. Zhang L, Fang B: Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in cancer. Cancer Gene Ther 2005, 12, 228-227.
9. Shankar S, Srivastava RK: Enhancement oh therapeutic potential of TRAIL by cancer chemotherapy and irradiation: mechanisms and clinical implications. Drug Resist Updat 2004, 7, 139-156.
10. Wu XX, Ogawa O, Kaleki Y: TRAIL and chemotherapeutic drugs in cancer therapy. Vitam Horm 2004, 67, 365-583.
11. Donat SM: Evaluation and follow-up strategies for superficial bladder cancer. Urol Clin North Am 2003, 30, 765-776.
12. Kyriazis AA, Kyriazis AP, McCombs WB, Peterson WD: Morphological, biological and biochemical characteristics oh human bladder transitional cell carcinomas grown in tissues culture and in nude mice. Cancer Res 1984, 44, 3397-4005.
13. Cell proliferation kit I (MTT). Instruction manual. Version 3. Roche Applied Science, Germany, 2003.
14. Cytotoxicity detection kit (LDH). Instruction manual. Version 5. Roche Applied Science, Germany, 2004.
15. Schenkman E, Lamm DL: Superficial bladder cancer therapy. Scientific World Journal 2004, 28, 387-399.
16. Pieras E, Palou J, Salvador J et al: Menagement and prognosis of transitional cell carcinoma superficial recurrence in muscle-invasive bladder cancer after bladder preservation. Eur Urol 2003, 44, 222-225.
17. Kołodziej A, Dembowski J: Chemioterapia dopęcherzowa w leczeniu powierzchownego raka pęcherza moczowego. Urol Pol 2002, 59, 9-14.
18. El-Zawahry AM, McKillop J, Voelkel-Johnson C: Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L. TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts. BMC Cancer 2005, 7, 2-5.
19. Kelly MM, Hoel BD, Voelkel-Johnson C: Doxorubicin pretreatment sensitizes prostate cancer cell lines to TRAIL induced apoptosis witch correlates with the loss of c-FLIP expression. Cancer Biol Ther 2002, 5, 520-527.
20. Kang J, Bu J, Hao Y, Chen F: Subtoxic concentration of doxorubicin enhances TRAIL-induced apoptosis in human prostate cell line LNCaP. Prostate Cancer Prostatic Dis 2005, 8, 274-279.
21. Wu XX, Kakehi Y, Mizutani Y et al: Doxorubicin enhances TRAIL-induced apoptosis in prostate cancer. Int. Oncol 2004, 20, 949-954.
22. Wu XX, Kakehi Y, Mizutani Y et al: Enhancement of TRAIL. Apo2L-mediated apoptosis by adriamycin through inducing DR4 and DR5 in renal cell carcinoma cells. Int J Cancer 2003, 104, 409-417.
23. Wu XX, Ogawa O, Kaleki Y: Sensitization of human renal cell carcinoma cell lines to TRAIL-induced apoptosis by anthracyclines. Int J Urol 2004, 11, 164-170.
24. Zisman A, Ng CP, Pantuck AJ: Actionomycin D and gemcitabine synergistically sensitize androgen-independent prostate cancer cells to APO2L. TRAIL-mediated apoptosis. J Immunother 2001, 24, 459-471.
25. Xu ZW, Kleeff J, Friess H et al: Synergistic cytotoxic effect of TRAIL and gemcitabine in pancreatic cancer cells. Anticancer Res 2003, 23, 251-258.
26. Hylander BL, Pitoniak R, Penetrante RB et al: The antitumor effect of APO2L. TRAIL on patient pancreatic adenocarcinoma grown as xenografts in SCID mice. J Transl Med 2005, 3, 22.
27. Zu H, Zhang L, Huang X et al: Overcoming acquired resistance to TRAIL by chemotherapeutic agents and calpain I through distinct mechanisms. Mol Ther 2004, 9, 666-673.
28. Mizutani Y, Nakao M, Ogawa O: Enhanced sensitivity of bladder cancer cells to tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand mediated apoptosis by cisplatin and carboplatin. J Urol 2001, 165, 263-270.

Ewelina Szliszka
Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii
41-808 Zabrze
ul. Jordana 19
tel. (032) 272 25 54
wkrol@slam.katowice.pl