english version wersja do druku
	kwartalnik ISSN 0500-7208 Czasopismo punktowane przez KBN, Index Copernicus oraz w bazie GBL

Kriogenika uzyskuje dwa odmienne efekty: zniszczenie komórek lub ich konserwację w niskiej temperaturze. Komórki mogą przetrwać w temperaturze do -2000 C pod warunkiem, że zamrażanie odbywać się będzie powoli przy równoczesnym odwodnieniu (9, 10, 11). Dużą rolę w tym procesie odgrywają roztwory osłaniające (cryopro - tectanta), dzięki którym nie dochodzi do wewnątrzkomórkowego wykrystalizowy­wania się wody (4, 7, 8, 12). Przy dużej szybkości procesu zamrażania dochodzi do wykrystalizowania wewnątrzkomórkowego, co jest równo­znaczne ze śmiercią komórki (7, 9). Powolne odmrażanie z kolei uszka­dza komórki w nie mniejszym stopniu niż szybkie zamrażanie, natomiast szybkie odmrażanie sprzyja ich przeżyciu (5, l2). Jednym z czynników przyspieszających odmrożenie jest obfite ukrwienie narządu (11).

W kriochirurgii narządów wewnętrznych badano efekty zamrożenia uprzednio naciętej wątroby i śledziony lub też zamrażano odcinki na­rządów, a następnie je odcinano (2, 5, 11). Opisano również wczesne i późne skutki zamrażania nerki krioaplikatorem przez 30 sek. (1).

W naszym poprzednim doniesieniu (6) omawiano makroskopowe wczes­ne i odległe zmiany po stosowaniu prototypu krioaplikatora. Celem ni­niejszej pracy było określenie granic zniszczenia kriogenicznie zmienio­nej tkanki nerkowej królika.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono u 15 królików obu płci, rasy mieszanej, wa­gi od 3,6 do 4,9 kg. W znieczuleniu dotchawicznym Nembutalem z użyciem respiratora do prowadzenia oddechu kontrolowanego odsłaniano zaotrzewnowo i wyłaniano lewą nerkę. Dolny biegun nerki zamrażano krioaplikatorem o średnicy 10 mm przez 3 min., odmrażano sposobem naturalnym (krążenie w nerce nie było upośledzone). Zwierzętom wycięto kriogenicznie zmienioną nerkę po upływie l5 min., 1, 12 i 24 go­dzin oraz 8, 14, 28, 33, 34 i 35 dób po wykonaniu zabiegu. Skrawki do badań histologicznych utrwalano w 10°/ obojętnym roztworze formaliny, opracowywano standardowo i barwiono HE. Do badań histo­enzymatycznych pobierano nerki po upływie 15 minut oraz 4 i 24 godzin od chwili zabiegu. Materiał do badań histoenzymatycznych zamrażano w mieszaninie suchego lodu z acetonem. Reakcje na obecność dehydro­genaz wykonywano z materiału nieutrwalonego. Materiał, z którego wy­konywano reakcje na obecność hydrolaz utrwalano w płynie Bakera 20 minut. Wykonano oznaczenia aktywności fosfalazy zasadowej (PZ.), ATP-azy dehydrogendzy kwasu bursztynowego (SDH) dehydrogenazy kwasu mllekowego (LDH) dehydrogenazy altagliaerofosforanu oraz oksy­dazy cytochromowej (CO)

Wyniki

U królika zabitego po uplywie l5 minut od chwili wykonania zabiegu makroskopowo stwierdzono obecność wyraźnie odgraniczonego ogniska marwicy. histologicznie w obrebie martwicy włośniczki kłębkowe i oko­łocewkowe były silnie wypełnione krwią. W najbliższym sąsiedztwie martwicy nie stwierdzono uchwytnych zmian.

Podobny obraz makroskopowy stwierdzono po upływie 1 i 12 godzin od zabiegu. Po upływie 24 godzin obok opisanych powyżej zmian w obrębie ogniska martwicy obecne były liczne granulocyty obojętno­chłonne.

W 8 dobie po zabiegu w obrębie ogniska martwicy włośniczki kłębko­we były puste lub zawierały nieznaczną ilość zhemolizowanej krwi. Natomiast w świetle naczyń śródmiąższowych obecne były dobrze za­chowane krwinki czerwone. Na obrzeżu martwicy widoczny był pas przekrwienia. W obrębie tego pasa w świetle cewek stwierdzono obec­ność wałeczków hemoglobulinowych. Na terenie ogniska martwicy, a zwłaszcza na powierzchni podtorebkowej występowały liczne macieki z granulocytów obojętnochłonnych. Powyższe zmiany utrzymywały się do 14 doby.

W okresie od 28 do 35 doby po zabiegu zmiany histologiczne były w zasadzie podobne. W obrę;bie ogniska martwicy obecne były liczne zwap­nienia, zaś na granicy ogniska martwicy z nieuszkodzoną tkanką wystę­powały niewielkie nacieki z komórek limfocytowatych oraz drobne złogi hemosyderyny. Ogniskowo w tym obszarze obserwowano również zmiany naczyniowe. Polegały one na rozplemie komórek śródbłonka, rozroście i ujednostajnieniu tkanki łącznej podśródbłonkowej. Dopro­wadzały one do pogrubienia ścian tętniczek i zwężenia ich światła. Naj­wyraźniej zmiany te występowaly u zwierząt zabitych po upływie 28 i 29 dób od chwili wykonania zabiegu. W bezpośrednim sąsiedztwie og­nka martwiczego, w odległości 1, 2, wyjatkowo 3 mm stwierdzano zmiany zwyrodnieniowe nabłonka cewek z rozpadem pojedyńczych ko­mórek. Występowały one ogniskowo. W świetle pojedyńczych cewek obecne były wałeczki hemoglobinowe.

Od 34 doby, obok opisanych powyżej zmian, w bezpośrednim sąsiedz­twie ogniska martwicy dochodzilo po proliferacji komórek nabłonka cewek. W niektórych cewkach była ona tak znaczna, że doprowadzała do wyraźnego zwężenia światła. W tym czasie obserwowano również nie­znaczny rozplem tkanki łącznej wokół ogniska martwicy.

W materiale badanym histoenzymatycznie w preparatach wykonanych po 15 minutach i po 4 godzinach można było wyróżnić trzy strefy:

1) martwicy

2)przejściową między martwicą a normalną tkanką nerkową

3)niezmienioną

W strefie martwicy nie stwierdzono odczynu dodatniego na obecność żadnego z badanych enzymów. W strefie przejściowej w cytoplaźmie nabłonka cewek obecny był słabo dodatni, gruboziarnisty, miejscami dy­fuzyjny odczyn na aktywność dehydrogenaz i oksydazy cytochromowej. W miarę oddalania się od ogniska martwicy następował wyraźny wzrost wymienionych wyżej odczynów. Wyraźnie dodatni był jedynie odczyn na dehydrogenazę alfa-glicefosforanu. Odczyn na obecność fosfatazy za­sadowej pojawiał się w strefie przejściowej tylko ogniskowo w rąbku szczoteczkowym komórek nabłonka cewek proksymalnych i dystalnych. Odczyn na obecność ATP-azy by słabo dodatni w śródbłonkach -naczyń znajdujących się na granicy martwicy. Wzrastał on stopniowo w naczy­niach znajdujących się w pewnej odległości od ogniska martwicy.

W trzeciej strefie wszystkie odczyny wypadały jak w zdrowej nerce królika. Dodatni drobnoziarnisty odczyn na obecność dehydrogenaz o-becny był w cytoplaźmie komórek nabłonka cewek proksymalnych i dy­stalnych, odczyn na obecność fosfatazy zasadowej w rąbku szczoteczko­wym cewek oraz w naczyniach włosowatych. Odczyn na obecność ATP­-azy wyraźny był w naczyniach śródmiąższowych oraz włośniczkach kłębkowych.

W materiale pobranym po 24 godzinach od chwili wykonania zabiegu można było wyróżnić, podobnie jak w poprzednio opisanym, trzy strefy. W porównaniu z wynikami otrzymanymi od zwierząt zabitych po 15 mi­nutach i 4 godzinach strefa pośrednia była wyraźnie węższa. U zwierząt opisanych powyżej wynosiła ona do 2 mm, po 24 godzinach uległa zwę­żeniu prawie o połowę. Odczyny na obecność dehydrogenaz były w tym obszarze słabo dodatnie. Produkt reakcji był gruboziarnisty, miejscami dyfuzyjny. W miarę oddalania się od ogniska martwicy obraz był coraz bardziej podobny do stwierdzonego u zwierząt zdrowych, a produkt reakcji rozmieszczony równomiernie.

Omówienie

Dla oceny możliwości zastosowania krioaplikacji w zabiegach chirur­gicznych na nerce ważna jest ocena stanu tkanki nerkowej w najbliż­szym otoczeniu martwicy kriogenicznej. Na podstawie przeprowadzo­nych przez nas badań można przyjąć, iż obszar ten o szerokości 1—2, wyjątkowo 3 mm jest stosunkowo niewielki. W badaniach histoenzyma-tycznych w sąsiedztwie martwicy stwierdzono już po upływie 15 minut od wykonania zabiegu obniżenie aktywności większości badanych enzy­mów. Zmiany te miały charakter rozlany. Obszar zmian histoenzyma-tycznych w sąsiedztwie ogniska martwicy był jednak po upływie 24 go­dzin od krioaplikacji wyraźnie mniejszy. Można więc przyjąć, iż w stre­fie pośredniej, a więc na obrzeżu lodowej półkuli tylko niewielka ilość komórek ulega trwałemu uszkodzeniu. W głębi lodowej półkuli, bliżej krioapłikatora, tkanka nerkowa uległa zupełnemu zniszczeniu. W pow­stałym ognisku martwicy pojawiły się po 24 godzinach granulocyty obo-jętnochłonne. W 8 dobie po krioaplikacji nasilił się na obrzeżu martwicy pas przekrwienia, a na terenie martwicy pojawiły się rozległe nacieki zapalne. Proces ten trwał do 2 tygodni po zabiegu. Dopiero po 4 tygod­niach stwierdzono liczne zwapnienia w obrębie ogniska martwicy, a na jej obrzeżu niewielkie nacieki z komórek limfocytowatych. W tym czasie dochodziło do pogrubienia ścian i zwężenia światła tętniczek. W 5 tygodniu po krioaplikacji na obrzeżu martwicy spostrzegano znaczną proliferację nabłonka cewek, prowadzącą niekiedy do zwężenia ich światła.

Nie możemy potwierdzić spostrzeżeń Breininga i in. (1), który zamra­żając nerkę przez 30 sekund ustalił najbardziej nasiloną aktywność pro-liferacyjną tkanki łącznej na 2—3 dzień pooperacyjny. Podkreśla on szybki proces gojenia krionekrozy. Najprawdopodobniej bardzo krótki czas zamrażania spowodował uzyskanie innych wyników niż nasze.

Wnioski

1.Krioaplikacja dolnego bieguna nerki królika stosowana przez 3 minuty powoduje powstanie wyraźnie odgraniczonego ogniska martwicy.

2.Na obrzeżu ogniska martwicy dochodzi do uszkodzenia 'miąższu z rozpadem pojedyńczych komórek. Badania histoenzymatyczne wykazują, iż strefa uszkodzenia komórek początkowo osiągająca szerokość do 3 mm ulega po upływie 24 godzin zwężeniu o połowę. Dowodzi to, że na obrzeżu tkanki martwej tylko niewielka liczba komórek ulega trwałemu uszkodzeniu.

3.Odczyn ze strony tkanki łącznej na obrzeżu martwicy rozpoczyna się około 8 doby. Około 6 tygodni po zabiegu dochodzi też do ogniskowych zmian w ścianach tętniczek i proliferacji nabłonka cewek.

1. Breining H., Helpap B., Minderjahn A., Lymberopoulos S.: Histological and autoradiographic istudies during wound healing in kidneys afteir local freezing. Urol. Res., 1974, 2, 29.
2. Cooper I. S.: Cryogenic surgery. New Engl. J Med., 1963, 268, 743.
3. Cooper I. S., Hirose T.: Application of cryogenic surgery to resection of parenchymal organs. New Engl. J. Med., 1966, 274, 15
4. Farrant J., Morris G. J.: Thermal shock and dilution shook as the causes of freezing injury. Cryobiology, 1973, 10, 134.
5. Fish J. C, Edwards R. L., Holaday W. J.: Freezing and heat coagulation as hemostatics in surgery of liver and spleen in dogs. J. Trauma, 1967, 7, 456.
6. Kroll J., Jurasz B., Atler J.: Zmiany w następstwie kriochirurgii nerki królika.
7. Litvan G. G.: Mechanism of cryoiniury in biological systems. Cryobiology, 1972, 9, 182.
8. Meryman H. T., Hornblower M.: Changes in red cells following rapid freezing with extracellular cryoprotective agents. Cryobiology, 1972, 9, 262.
9. Schrott K. M., Sigel A.: Untersuchungen uber die Gefriergeschwindigkeit des neuen Kaltedusensystems. Der Urologe, 1970, 9, 295.
10. Smith J. J., Fraser J.: An estimation of tissue damage and thermal history in the cryolesion. Cryobiology, 1974, 11, 139.
11. Stucke K.: Tierexperimentelle Untersuchungen aur Kryochirurgie der Leber. Langenb. Arch. klin. Chir., 966, 316, 914.
12. Voss W. A. C, Warby C, Rajotte R., Ashwood-Smith M. J.: Microwave thawiing of tissue culture cells. Cryobiology, 1972, 9, 562.

Klinika Urologiczna AM
ul. Długa 1/2
61-848 Poznań